304 ҷузъҳои кимиёвии қубурҳои пӯлоди зангногир, Сохтори эктодомени SPACA6 дорои суперфамилии ҳифзшудаи сафедаҳо мебошад, ки бо синтези гаметаҳо алоқаманданд.

Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Слайдерҳо се мақоларо дар як слайд нишон медиҳанд.Барои гузаштан дар слайдҳо тугмаҳои қафо ва ояндаро истифода баред ё тугмаҳои контролери слайдро дар охири ҳар як слайд ҳаракат кунед.

SPACA6 як протеини рӯи сперма мебошад, ки барои синтези гаметаҳо ҳангоми таҷдиди ҷинсии ширхӯрон муҳим аст.Сарфи назар аз ин нақши асосӣ, вазифаи мушаххаси SPACA6 ба таври кофӣ дарк карда нашудааст.Мо сохтори кристаллии домени берун аз ҳуҷайравии SPACA6-ро бо қарори 2,2 Å муайян мекунем, ки протеини ду-домениро, ки аз бастаи чорқаба ва β-сандвичҳои ба Ig монанд, ки бо пайвандакҳои квази чандир пайваст шудаанд, ошкор мекунем.Ин сохтор ба IZUMO1 шабоҳат дорад, дигар протеини бо синтези гамета алоқаманд ва SPACA6 ва IZUMO1-ро аъзои асосгузори супероилаи сафедаҳои бо бордоршавӣ алоқаманд месозад, ки дар инҷо ҳамчун супероилаи IST номида мешаванд.Супероилаи IST аз ҷиҳати сохторӣ бо бастаи чор-спирали печидаи он ва як ҷуфт мотивҳои ба дисульфид алоқаманд CXXC муайян карда мешавад.Ҷустуҷӯи AlphaFold дар асоси сохтори протеоми инсон аъзои сафедаи иловагии ин суперфамиларо муайян кард;махсусан, бисёре аз ин сафедаҳо дар синтези gamete иштирок мекунанд.Сохтори SPACA6 ва муносибати он бо дигар аъзоёни супероилаи IST пайванди гумшударо дар дониши мо дар бораи синтези гаметаҳои ширхӯрон таъмин мекунанд.
Ҳар як ҳаёти инсон аз ду гаметаи алоҳидаи гаплоид оғоз меёбад: нутфаи падар ва тухми модар.Ин нутфа ғолиби як раванди пуршиддати интихоб мебошад, ки дар давоми он миллионҳо ҳуҷайраҳои нутфа аз узвҳои таносули занона гузашта, монеаҳои гуногунро паси сар мекунанд1 ва аз capacitation мегузарад, ки ҳаракати онҳо ва ҷараёни ҷузъҳои рӯизаминиро баланд мебардорад2,3,4.Ҳатто агар нутфа ва овоцит ҳамдигарро пайдо кунанд ҳам, раванд ҳанӯз ба охир нарасидааст.Ооситро як қабати ҳуҷайраҳои ҷамъшуда ва монеаи гликопротеинӣ иҳота кардааст, ки zona pellucida номида мешавад, ки нутфа бояд тавассути он барои ворид шудан ба овосит гузарад.Spermatozoa маҷмӯи молекулаҳои адгезияи рӯизаминӣ ва ферментҳои бо мембрана алоқаманд ва ҷудошавандаро барои бартараф кардани ин монеаҳои ниҳоӣ истифода мебаранд5.Ин молекулаҳо ва ферментҳо асосан дар мембранаи ботинӣ ва матритсаи акросомалӣ нигоҳ дошта мешаванд ва ҳангоми лиз шудани мембранаи берунии нутфа ҳангоми реаксияи акросомалӣ ошкор карда мешаванд6.Қадами ниҳоии ин сафари пуршиддат ҳодисаи омезиши нутфа-тухм мебошад, ки дар он ду ҳуҷайра мембранаҳои худро ба ҳам мепайвандад, то як организми ягонаи диплоид шаванд7.Гарчанде ки ин раванд дар таҷдиди инсон бунёдкор аст, аммо таъсири мутақобилаи зарурии молекулавӣ ба таври кофӣ дарк карда нашудааст.
Илова ба бордоркунии гаметаҳо, химияи омезиши ду қабати липидҳо васеъ омӯхта шудааст.Умуман, синтези мембранаҳо як раванди номусоиди энергетикӣ мебошад, ки катализатори сафедаро талаб мекунад, ки тағирёбии конформатсияи сохториро тақозо кунад, ки ду мембранаро ба ҳам наздик карда, муттасилии онҳоро вайрон карда, синтезро ба вуҷуд меорад8,9.Ин катализаторҳои сафеда ҳамчун фузогенҳо маълуманд ва дар системаҳои бешумори синтез пайдо шудаанд.Онҳо барои воридшавии вирус ба ҳуҷайраҳои мизбон заруранд (масалан, gp160 дар ВИЧ-1, хӯша дар коронавирусҳо, гемагглютинин дар вирусҳои зуком) 10,11,12 пласенталӣ (синситин)13,14,15 ва синтези гаметаҳо дар эукариотҳои поёнӣ ( HAP2/GCS1 дар растаниҳо, протистҳо ва буғумҳо) 16,17,18,19.Фузогенҳо барои гаметаҳои инсон ҳанӯз кашф карда нашудаанд, гарчанде ки якчанд сафедаҳо барои пайвастшавӣ ва синтези гаметаҳо муҳиманд.CD9, протеини трансмембрание, ки барои омезиши муш ва гаметаҳои инсон зарур аст, ки бо оосит ифода шудааст, аввалин шуда кашф карда шуд 21,22,23.Гарчанде ки вазифаи дақиқи он норавшан боқӣ мемонад, нақш дар пайвастшавӣ, сохтори фокусҳои пайвастшавӣ дар микровиллҳои тухм ва/ё ҷойгиршавии дурусти сафедаҳои рӯи oocyte эҳтимолан ба назар мерасад 24,25,26.Ду сафедаи маъмултарин, ки барои синтези гаметаҳо муҳиманд, протеини нутфа IZUMO127 ва протеини оосити JUNO28 мебошанд ва ассотсиатсияи мутақобилаи онҳо як қадами муҳим дар шинохти гаметаҳо ва пайвастшавӣ пеш аз синтез мебошад.Мушҳои нокаутии мардона Изумо1 ва мушҳои нокаутии зани Юно комилан безарар мебошанд, дар ин моделҳо сперма ба фазои перивителлинӣ дохил мешаванд, аммо гаметаҳо ба ҳам намепайванданд.Ба ҳамин монанд, ҳангоми коркарди гаметаҳо бо антителоҳои зидди IZUMO1 ё JUNO27,29 дар таҷрибаҳои бордоркунии инсон дар экстракорпоратсия коҳиш ёфт.
Ба наздикӣ, як гурӯҳи тозаи сафедаҳои бо сперма ифодаёфта кашф карда шуд, ки аз ҷиҳати фенотип ба IZUMO1 ва JUNO20,30,31,32,33,34,35 шабоҳат доранд.Протеини 6, ки бо мембранаи акросомалии сперма алоқаманд аст (SPACA6) дар таҳқиқоти васеъмиқёси мутагенези мурин барои бордоршавӣ муҳим муайян карда шудааст.Ворид кардани трансген ба гени Spaca6 сперматозоидҳои ғайриманқулро ба вуҷуд меорад, гарчанде ки ин сперматозоидҳо ба фазои перивителлинӣ 36 ворид мешаванд.Тадқиқотҳои минбаъдаи нокаут дар мушҳо тасдиқ карданд, ки Spaca6 барои синтези gamete 30,32 лозим аст.SPACA6 тақрибан танҳо дар тестҳо ифода карда мешавад ва дорои шакли локализатсияи шабеҳи IZUMO1 мебошад, яъне дар дохили интимаи сперматозоидҳо пеш аз реаксияи акросомалӣ ва баъд аз реаксияи акросомалӣ ба минтақаи экваториалӣ 30,32 муҳоҷират мекунад.Гомологҳои Spaca6 дар намудҳои гуногуни ширхӯрон ва дигар эукариотҳо мавҷуданд 30 ва аҳамияти он барои синтези гаметаҳои инсон бо ҷилавгирӣ аз бордоркунии инсон дар vitro бо муқовимат ба SPACA6 30 нишон дода шудааст.Баръакси IZUMO1 ва JUNO, тафсилоти сохтор, таъсири мутақобила ва вазифаи SPACA6 норавшан боқӣ мемонад.
Барои беҳтар фаҳмидани раванди бунёдии асоси омезиши нутфа ва тухмҳои инсон, ки ба мо имкон медиҳад, ки дар бораи пешрафтҳои оянда дар банақшагирии оила ва табобати таваллуд маълумот диҳем, мо таҳқиқоти сохторӣ ва биохимиявии SPACA6 гузаронидем.Сохтори булӯрии домени берун аз ҳуҷайравии SPACA6 як бастаи чор-спиралӣ (4HB) ва домени ба иммуноглобулин монандро (Ig-монанд) нишон медиҳад, ки бо минтақаҳои квази фасеҳ пайваст шудаанд.Тавре ки дар таҳқиқоти қаблӣ пешбинӣ шуда буд, 7,32,37 сохтори домени SPACA6 ба сохтори IZUMO1-и инсон шабоҳат дорад ва ду сафеда як мотиви ғайриоддиро мубодила мекунанд: 4HB бо сатҳи спирали секунҷа ва як ҷуфт мотивҳои ба дисульфид алоқаманд CXXC.Мо пешниҳод менамоем, ки IZUMO1 ва SPACA6 ҳоло як оилаи калонтар ва аз ҷиҳати сохторӣ алоқаманди сафедаҳои марбут ба синтези гаметаро муайян мекунанд.Бо истифода аз хусусиятҳои хоси супероила, мо ҷустуҷӯи мукаммали протеомаи сохтории инсонии AlphaFold гузаронидем, ки аъзои иловагии ин суперфамиларо муайян кардем, аз ҷумла чанд аъзои дар синтез ва/ё бордоршавӣ иштирокдошта.Ҳоло чунин ба назар мерасад, ки як қабати умумии сохторӣ ва суперфамилияи сафедаҳое вуҷуд дорад, ки бо синтези гаметаҳо алоқаманданд ва сохтори мо харитаи молекулавии ин ҷанбаи муҳими механизми синтези гаметаҳои инсонро таъмин мекунад.
SPACA6 як протеини трансмембрании якгузар бо як гликани ба N пайваст ва шаш пайванди дисульфиди тахминӣ мебошад (Рақмҳои S1a ва S2).Мо домени берун аз ҳуҷайравии SPACA6-и инсонро (боқимондаҳои 27-246) дар ҳуҷайраҳои Drosophila S2 ифода кардем ва сафедаро бо истифода аз наздикии никел, мубодилаи катион ва хроматографияи истисноии андоза тоза кардем (расми S1b).Эктодомени тозашудаи SPACA6 хеле устувор ва якхела аст.Таҳлил бо истифода аз хроматографияи истисноии андоза дар якҷоягӣ бо парокандакунии нури бисёркунҷа (SEC-MALS) як қулларо бо вазни ҳисобшудаи молекулавии 26,2 ± 0,5 кДа ошкор кард (расми S1c).Ин ба андозаи эктодомени мономерии SPACA6 мувофиқ аст, ки нишон медиҳад, ки олигомеризатсия ҳангоми тозакунӣ рух надодааст.Гайр аз ин, спектроскопияи дихроизми доирашакл (КД) сохтори омехтаи α/β-ро бо нуқтаи обшавии 51,3°С ошкор намуд (расми S1d,e).Деконволютсияи спектрҳои CD 38,6% элементҳои α-спирал ва 15,8% β-қаторро ошкор карданд (расми S1d).
Эктодомени SPACA6 бо истифода аз кишти тасодуфии матритса38 кристалл карда шуд, ки дар натиҷа маҷмӯи маълумот бо қарори 2,2 Å (Ҷадвали 1 ва Расми S3) ба даст омад.Бо истифода аз маҷмӯи ивазкунии молекулавӣ дар асоси фрагментҳо ва маълумоти марҳиласозии SAD бо экспозицияи бромид барои муайян кардани сохтор (Ҷадвали 1 ва Расми S4), модели ниҳоии тозашуда аз пасмондаҳои 27-246 иборат аст.Ҳангоми муайян кардани сохтор, ягон сохтори таҷрибавӣ ё AlphaFold мавҷуд набуд.Эктодомени SPACA6 андозаи 20 Å × 20 Å × 85 Å буда, аз ҳафт спирал ва нӯҳ риштаи β иборат аст ва дорои қабати сеюми дарозрӯя, ки бо шаш пайванди дисульфидӣ устувор шудааст (расми 1а, б).Зичии заифи электронҳо дар охири занҷири паҳлӯии Asn243 нишон медиҳад, ки ин боқимонда гликозилизатсияи бо N алоқаманд аст.Сохтор аз ду домен иборат аст: бастаи N-терминали чор-спиралӣ (4HB) ва домени C-терминали Ig монанд бо минтақаи ҳалқаи фосилавии байни онҳо (расми 1c).
Сохтори домени берун аз ҳуҷайраҳои SPACA6.Диаграммаи рахи домени берун аз ҳуҷайраи SPACA6, ранги занҷир аз N то C-терминус аз кабуди торик то сурхи торик.Цистеинҳое, ки дар пайвандҳои дисульфидӣ иштирок мекунанд, дар ранги сурх нишон дода шудаанд.б Топологияи домени берун аз ҳуҷайраи SPACA6.Ҳамон схемаи рангро, ки дар расми 1а истифода кардааст, истифода баред.c SPACA6 домени берун аз ҳуҷайра.Диаграммаҳои рахи домени 4HB, ҳалқа ва Ig монанданд, мутаносибан норанҷӣ, сабз ва кабуд мебошанд.Қабатҳо ба миқёс кашида намешаванд.
Домени 4HB-и SPACA6 чор чархаи асосиро (спиралҳои 1–4) дар бар мегирад, ки дар шакли чархи чархзанӣ ҷойгир шудаанд (расми 2а), дар байни таъсири мутақобилаи зидди параллелӣ ва параллелӣ иваз мешаванд (расми 2б).Спирали хурди иловагии як гардиш (спирали 1') ба баста перпендикуляр гузошта шуда, секунҷаи дорои спиралҳои 1 ва 2-ро ташкил медиҳад. Ин секунҷа дар бастабандии спиралии нисбатан зиччи спиралҳои 3 ва 4 каме деформатсия шудааст ( Расми 2а).
Диаграммаи рахи 4HB N-терминал.б Намоиши болоии бастаи чор спирал, ки ҳар як спирал дар терминали N бо кабуди торик ва дар терминали C сурхи торик нишон дода шудааст.в Диаграммаи чархи спиралии аз боло ба поён барои 4HB, бо ҳар як боқимонда ҳамчун доира нишон дода шудааст, ки бо рамзи як ҳарфи аминокислотаҳо нишон дода шудааст;танҳо чор аминокислотаҳо дар болои чарх рақамгузорӣ карда шудаанд.Боқимондаҳои ғайриқутбӣ ранги зард доранд, пасмондаҳои заряднашудаи қутбӣ сабз, боқимондаҳои заряди мусбат кабуд ва боқимондаҳои заряднок манфӣ ранги сурх доранд.d Чеҳраҳои секунҷаи домени 4HB, бо 4HBs дар афлесун ва болгаҳо бо сабз.Ҳарду қисмҳо пайвандҳои дисульфиди асоишаклро нишон медиҳанд.
4HB дар як ядрои ботинии гидрофобӣ мутамарказ шудааст, ки асосан аз пасмондаҳои алифатикӣ ва хушбӯй иборат аст (расми 2c).Дар ядро ​​пайванди дисульфиди байни Cys41 ва Cys55 мавҷуд аст, ки чархҳои 1 ва 2-ро дар секунҷаи болобардошта мепайвандад (расми 2d).Дар байни мотиви CXXC дар Helix 1 ′ ва як мотиви дигари CXXC, ки дар нӯги β-мӯй дар минтақаи ҳалқа пайдо шудааст, ду пайванди иловагии дисульфидӣ ташкил карда шуд (расми 2d).Боқимондаи консервативии аргинин бо функсияи номаълум (Arg37) дар дохили секунҷаи холӣ ҷойгир аст, ки аз спиралҳои 1′, 1 ва 2 ба вуҷуд омадаанд. Атомҳои карбон алифатии Cβ, Cγ ва Cδ Arg37 бо ядрои гидрофобӣ ҳамкорӣ мекунанд ва гурӯҳҳои гуанидини он ба таври даврӣ ҳаракат мекунанд. байни чархҳои 1′ ва 1 тавассути таъсири мутақобила байни шоҳроҳи Thr32 ва занҷири паҳлӯ (расми S5a, b).Tyr34 ба холигоҳ паҳн мешавад, ки ду холигии хурдро тарк мекунад, ки тавассути он Arg37 метавонад бо ҳалкунанда муошират кунад.
Доменҳои ба Ig монанд ба β-сэндвичҳо як оилаи калони сафедаҳо мебошанд, ки хусусияти умумии ду ё зиёда варақаҳои амфипатикии амфипатикӣ доранд, ки тавассути як ядрои гидрофобӣ ҳамкорӣ мекунанд 39. Домени C-терминали Ig-и SPACA6 як намуна дорад. ва аз ду қабат иборат аст (расми S6a).Лавҳаи 1 β-варақи чаҳор ришта (риштаҳои D, F, H ва I) мебошад, ки дар он риштаҳои F, H ва I як сохтори зидди параллелӣ ташкил медиҳанд ва риштаҳои I ва D таъсири мутақобилаи параллелӣ мегиранд.Ҷадвали 2 як варақи хурди зидди параллели дуқабата бета мебошад (риштаҳои E ва G).Дар байни С-терминуси занҷири Е ва маркази занҷири H (Cys170-Cys226) пайванди дохилии дисульфидӣ мушоҳида карда шуд (расми S6b).Ин пайванди дисульфидӣ ба пайванди дисульфидӣ дар домени β-сандвичҳои иммуноглобулин монанд аст40,41.
Варақаи чор риштаи β дар тамоми дарозии худ печида, кунҷҳои асимметриро ташкил медиҳанд, ки аз рӯи шакл ва электростатика фарқ мекунанд.Канори бориктар як сатҳи ҳамвории гидрофобии муҳити зист аст, ки дар муқоиса бо сатҳи боқимондаи нобаробар ва аз ҷиҳати электростатикӣ гуногун дар SPACA6 фарқ мекунад (расми S6b,c).Галои устухони фошшудаи карбонил/гурӯҳҳои аминокислотаҳо ва занҷирҳои паҳлӯии қутбӣ сатҳи гидрофобиро иҳота мекунад (расми S6c).Маржаи васеътар аз ҷониби сегменти спиралии сарпӯшшуда фаро гирифта шудааст, ки қисми N-терминали ядрои гидрофобиро маҳкам мекунад ва се пайванди гидрогениро бо гурӯҳи қутбии кушодаи шоҳроҳи занҷири F ташкил медиҳад (расми S6d).Қисми C-терминали ин канор як ҷайби калонро бо ядрои қисман фошшудаи гидрофобӣ ташкил медиҳад.Киса аз ҳисоби се маҷмӯи пасмондаҳои дукаратаи аргинин (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ва Arg212-Arg214) ва гистидини марказӣ (His220) бо зарядҳои мусбат иҳота шудааст (Расми S6e).
Минтақаи ҳалқа як сегменти кӯтоҳ байни домени спиралӣ ва домени ба Ig монанд буда, аз як қабати зиддипараллӣ сеқабати β (қаторҳои A, B ва C), як чархаи хурди 310 ва якчанд сегментҳои дарози спиралии тасодуфӣ иборат аст.(расми S7).Чунин ба назар мерасад, ки шабакаи алоқаҳои ковалентӣ ва электростатикӣ дар минтақаи ҳалқа барои мӯътадил кардани самти байни 4HB ва домени монанд ба Ig.Шабакаро ба се қисм тақсим кардан мумкин аст.Қисми аввал ду мотиви CXXC (27CXXC30 ва 139CXXC142) -ро дар бар мегирад, ки як ҷуфт пайвандҳои дисульфидро байни β-мӯй дар ҳалқа ва спирали 1' дар 4HB ташкил медиҳанд.Қисми дуюм таъсири мутақобилаи электростатикӣ байни домени Ig ва ҳалқаро дар бар мегирад.Glu132 дар ҳалқа як пули намакро бо Arg233 дар домени ба Ig монанд ва Arg135 дар ҳалқа ташкил медиҳад.Қисми сеюм пайванди ковалентии байни домени ба Ig монанд ва минтақаи ҳалқаро дар бар мегирад.Ду пайванди дисульфидӣ (Cys124-Cys147 ва Cys128-Cys153) ҳалқаи ҳалқаро ба пайвандкунанда мепайвандад, ки тавассути таъсири мутақобилаи электростатикӣ байни Gln131 ва гурӯҳи функсионалии сутунмӯҳра мӯътадил карда мешавад, ки дастрасӣ ба аввалин домени Ig монандро фароҳам меорад.занҷир.
Сохтори ectodomain SPACA6 ва сохторҳои алоҳидаи доменҳои 4HB ва Ig-монанд барои ҷустуҷӯи сабтҳои сохтории шабеҳ дар пойгоҳи додаҳои сафедаҳо 42 истифода шуданд.Мо мувофиқатҳоро бо холҳои баланди Dali Z, инҳирофҳои хурди стандартӣ ва холҳои калони LALI муайян кардем (охирин шумораи пасмондаҳои сохторӣ баробаранд).Дар ҳоле ки 10 хитҳои аввал аз ҷустуҷӯи пурраи эктодомен (Ҷадвали S1) холҳои қобили қабули Z-и >842 доштанд, танҳо як ҷустуҷӯи домени 4HB ё Ig монанд нишон дод, ки аксари ин хитҳо танҳо ба β-сэндвичҳо мувофиқанд.як қабати дар ҳама ҷо мавҷудбуда дар бисёр сафедаҳо.Ҳар се ҷустуҷӯ дар Дали танҳо як натиҷа доданд: IZUMO1.
Кайҳо боз пешниҳод шудааст, ки SPACA6 ва IZUMO1 шабоҳатҳои сохториро тақсим мекунанд7,32,37.Гарчанде ки эктодоменҳои ин ду сафедаи синтези гамета алоқаманд танҳо 21% мушаххасоти пайдарпайро тақсим мекунанд (Расми S8a), далелҳои мураккаб, аз ҷумла шакли нигоҳдошташудаи пайванди дисульфидӣ ва домени пешбинишудаи C-терминали Ig дар SPACA6, имкон доданд, ки кӯшишҳои барвақт барои сохтани як модели гомологии муши A ва SPACA6 бо истифода аз IZUMO1 ҳамчун қолаб37.Сохтори мо ин пешгуихоро тасдик мекунад ва дарачаи хакикии монандй-ро нишон медихад.Дарвоқеъ, сохторҳои SPACA6 ва IZUMO137,43,44 як меъмории ду-домениро мубодила мекунанд (расми S8b) бо доменҳои шабеҳи 4HB ва Ig-и β-сандвич, ки тавассути минтақаи ҳалқа пайвастанд (расми S8c).
IZUMO1 ва SPACA6 4HB аз бастаҳои анъанавии спиралӣ фарқиятҳои умумӣ доранд.4HB-ҳои маъмулӣ, ба монанди комплексҳои сафедаи SNARE, ки дар синтези эндосомӣ 45,46 ҷойгиранд, спиралҳои баробар ҷойгир шудаанд, ки каҷравии доимиро дар атрофи меҳвари марказӣ нигоҳ медоранд 47. Баръакс, доменҳои спиралӣ дар ҳам IZUMO1 ва ҳам SPACA6 таҳриф шудаанд, бо каҷравии тағйирёбанда ва бастабандии нобаробар (расми S8d).Твист, ки эҳтимол аз секунҷае, ки аз спиралҳои 1′, 1 ва 2 ба вуҷуд омадааст, дар IZUMO1 ва SPACA6 нигоҳ дошта мешавад ва бо ҳамон як мотиви CXXC дар спирали 1 мӯътадил карда мешавад.Аммо, пайванди иловагии дисульфид, ки дар SPACA6 пайдо шудааст (Cys41 ва Cys55 ковалентии спиралҳои 1 ва 2-ро дар боло мепайвандад) дар қуллаи секунҷа як қуллаи тезтарро ба вуҷуд меорад, ки SPACA6-ро нисбат ба IZUMO1 печидатар мекунад ва секунҷаҳои холигии возеҳтар доранд.Илова бар ин, IZUMO1 Arg37 надорад, ки дар маркази ин пуфак дар SPACA6 мушоҳида мешавад.Баръакси ин, IZUMO1 дорои як ядрои маъмултарини гидрофобӣ аз пасмондаҳои алифатикӣ ва хушбӯй мебошад.
IZUMO1 дорои домени ба Ig монанд аст, ки аз як варақи дуқабата ва панҷқатор β43 иборат аст.Қатори иловагӣ дар IZUMO1 печи SPACA6-ро иваз мекунад, ки бо риштаи F барои маҳдуд кардани пайвандҳои гидрогении сутунмӯҳра дар ришта ҳамкорӣ мекунад.Нуктаи ҷолиби муқоиса заряди пешбинишудаи сатҳи доменҳои ба Ig монанд ду сафеда мебошад.Сатҳи IZUMO1 нисбат ба сатҳи SPACA6 манфӣ бештар аст.Заряди иловагӣ дар наздикии терминали С ҷойгир аст, ки ба мембранаи нутфа рӯбарӯ шудааст.Дар SPACA6, ҳамон минтақаҳо бештар бетараф ё заряди мусбат буданд (расми S8e).Масалан, сатҳи гидрофобӣ (кунҷҳои бориктар) ва чоҳҳои мусбат заряднок (кунҳои васеътар) дар SPACA6 дар IZUMO1 манфӣ заряднок шудаанд.
Гарчанде ки муносибат ва унсурҳои сохтори дуюмдараҷаи байни IZUMO1 ва SPACA6 хуб нигоҳ дошта шудаанд, ҳамбастагии сохтории доменҳои ба Ig монандро нишон дод, ки ин ду домен дар самти умумии худ нисбат ба ҳамдигар фарқ мекунанд (расми S9).Маҷмӯи спиралии IZUMO1 дар атрофи β-сэндвич каҷ шуда, шакли қаблан тавсифшудаи "бумеранг"-ро дар масофаи тақрибан 50° аз меҳвари марказӣ ба вуҷуд меорад.Баръакс, чӯби спиралӣ дар SPACA6 ба самти муқобил тақрибан 10 ° майл карда шуд.Тафовут дар ин самтҳо эҳтимол аз фарқият дар минтақаи ҳалқа вобаста аст.Дар сатҳи аввалия, IZUMO1 ва SPACA6 дар ҳалқа шабоҳати пайдарпайии кам доранд, ба истиснои боқимондаҳои систеин, глицин ва кислотаи аспартик.Дар натиҷа, пайвандҳои гидрогенӣ ва шабакаҳои электростатикӣ комилан фарқ мекунанд.Унсурҳои сохтори дуюмдараҷаи β-варақ аз ҷониби IZUMO1 ва SPACA6 мубодила мешаванд, гарчанде ки занҷирҳо дар IZUMO1 хеле дарозтаранд ва спирали 310 (спирали 5) барои SPACA6 беназир аст.Ин фарқиятҳо ба самтҳои гуногуни домен барои ду сафедаи ба таври дигар монанд оварда мерасонанд.
Ҷустуҷӯи сервери Дали мо нишон дод, ки SPACA6 ва IZUMO1 танҳо ду сохтори таҷрибавӣ муайяншуда дар базаи сафедаҳо нигоҳ дошта мешаванд, ки ин қабати махсуси 4HB доранд (Ҷадвали S1).Ба наздикӣ, DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold, як системаи ба шабакаи нейронӣ асосёфтаро таҳия кардааст, ки метавонад сохторҳои 3D сафедаҳоро аз пайдарпаии аввалия дақиқ пешгӯӣ кунад48.Чанде пас аз он ки мо сохтори SPACA6-ро ҳал кардем, пойгоҳи додаи AlphaFold бароварда шуд, ки моделҳои пешгӯии сохторро таъмин мекунад, ки 98,5% тамоми сафедаҳои протеомаи инсонро фаро мегирад48,49.Бо истифода аз сохтори ҳалшудаи SPACA6 ҳамчун модели ҷустуҷӯ, ҷустуҷӯи гомологии сохторӣ барои модел дар протеоми инсонии AlphaFold номзадҳоро бо монандии эҳтимолии сохторӣ ба SPACA6 ва IZUMO1 муайян кард.Бо назардошти дақиқии бебаҳои AlphaFold дар пешгӯии SPACA6 (Расми S10a) - махсусан эктодомени 1.1 Å rms дар муқоиса бо сохтори ҳалшудаи мо (расми S10b) - мо метавонем итминон дошта бошем, ки мувофиқати муайяншудаи SPACA6 эҳтимолан дақиқ аст.
Қаблан, PSI-BLAST кластери IZUMO1-ро бо се сафедаи дигари бо сперма алоқаманд ҷустуҷӯ мекард: IZUMO2, IZUMO3 ва IZUMO450.AlphaFold пешгӯӣ кард, ки ин сафедаҳои оилаи IZUMO ба домени 4HB бо як шакли пайванди дисульфидӣ ҳамчун IZUMO1 (Рақмҳои 3a ва S11) печида мешаванд, гарчанде ки онҳо домени ба Ig монанд надоранд.Тахмин меравад, ки IZUMO2 ва IZUMO3 сафедаҳои мембранаи яктарафа ба IZUMO1 монанданд, дар ҳоле ки IZUMO4 ба назар мерасад.Функсияҳои сафедаҳои IZUMO 2, 3 ва 4 дар синтези гаметаҳо муайян карда нашудаанд.Маълум аст, ки IZUMO3 дар биогенези акросома ҳангоми инкишофи нутфа51 нақш мебозад ва сафедаи IZUMO пайдо шудааст, ки комплексро ташкил медиҳад50.Нигоҳдории сафедаҳои IZUMO дар ширхӯрон, хазандагон ва амфибияҳо аз он шаҳодат медиҳад, ки вазифаи потенсиалии онҳо бо дигар сафедаҳои маълуми гамета бо синтез алоқаманд, ба монанди DCST1/2, SOF1 ва FIMP мувофиқат мекунад.
Диаграммаи меъмории домени суперфамилияи IST бо доменҳои ба 4HB, ҳалқа ва Ig монанд, мутаносибан бо норанҷӣ, сабз ва кабуд таъкид шудаанд.IZUMO4 як минтақаи беназири C-терминали дорад, ки сиёҳ ба назар мерасад.Пайвандҳои тасдиқшуда ва тахминии дисульфидӣ мутаносибан бо хатҳои сахт ва нуқта нишон дода шудаанд.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1Zold (TMEMAl89) ва DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) дар ҳамон диапазони рангҳо бо панели A нишон дода мешаванд. Пайвастҳои дисульфидӣ бо ранги гулобӣ нишон дода шудаанд.Спиральҳои трансмембрании TMEM95, IZUMO2 ва IZUMO3 нишон дода нашудаанд.
Баръакси сафедаи IZUMO, сафедаҳои дигари SPACA (яъне, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 ва SPACA9) аз ҷиҳати сохторӣ аз SPACA6 фарқ мекунанд (расми S12).Танҳо SPACA9 дорои 4HB аст, аммо интизор нест, ки он як самти параллелӣ-зидди параллелӣ ё ҳамон пайванди дисульфидиро мисли SPACA6 дошта бошад.Танҳо SPACA1 домени шабеҳи Ig дорад.AlphaFold пешгӯӣ мекунад, ки SPACA3, SPACA4 ва SPACA5 нисбат ба SPACA6 сохтори комилан дигар доранд.Ҷолиб он аст, ки SPACA4 инчунин маълум аст, ки дар бордоршавӣ нақш мебозад, аммо ба андозаи бештар аз SPACA6, ба ҷои он, ки таъсири мутақобилаи байни нутфа ва зона pellucida oocyte52 мусоидат кунад.
Ҷустуҷӯи мо AlphaFold мувофиқи дигар барои IZUMO1 ва SPACA6 4HB, TMEM95 ёфт.TMEM95, як протеини ягонаи трансмембрании мушаххаси нутфа, мушҳои нарро ҳангоми аз байн бурдани 32,33 безурёт мегардонад.Сперматозае, ки TMEM95 надошт, морфологияи муқаррарӣ, ҳаракатнокӣ ва қобилияти ворид шудан аз zona pellucida ва пайваст шудан ба мембранаи тухмро дошт, аммо бо мембранаи оосит муттаҳид шуда наметавонист.Таҳқиқоти қаблӣ нишон доданд, ки TMEM95 бо IZUMO133 шабоҳатҳои сохторӣ дорад.Дарвоқеъ, модели AlphaFold тасдиқ кард, ки TMEM95 як 4HB бо ҳамон ҷуфтҳои CXXC ҳамчун IZUMO1 ва SPACA6 ва ҳамон пайванди иловагии дисульфиди байни чархҳои 1 ва 2 дар SPACA6 мавҷуд аст (расми 3a ва S11).Гарчанде ки TMEM95 домени ба Ig монанд надорад, он дорои як минтақаи дорои шакли пайванди дисульфидӣ ба минтақаҳои ҳалқаи SPACA6 ва IZUMO1 мебошад (расми 3b).Ҳангоми нашри ин дастнавис, сервери пешазинтихоботӣ дар бораи сохтори TMEM95 хабар дод, ки натиҷаи AlphaFold53-ро тасдиқ мекунад.TMEM95 ба SPACA6 ва IZUMO1 хеле шабоҳат дорад ва ба таври эволютсионӣ аллакай дар амфибияҳо ҳифз шудааст (расми 4 ва S13).
Ҷустуҷӯи PSI-BLAST аз пойгоҳи додаҳои NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP ва SOF1 барои муайян кардани мавқеъи ин пайдарпайҳо дар дарахти ҳаёт истифода бурд.Масофаҳои байни нуқтаҳои филиалҳо ба миқёс нишон дода намешаванд.
Шабеҳи умумии сохтории байни SPACA6 ва IZUMO1 аз он шаҳодат медиҳад, ки онҳо аъзои асосгузори супероилаи сохтории ҳифзшуда мебошанд, ки сафедаҳои TMEM95 ва IZUMO 2, 3 ва 4-ро дар бар мегиранд.аъзои маълум: IZUMO1, SPACA6 ва TMEM95.Азбаски танҳо якчанд аъзо доменҳои ба Ig монанд доранд, аломати супероилаи IST домени 4HB мебошад, ки дорои хусусиятҳои хоси барои ҳамаи ин сафедаҳо маъмул аст: 1) 4HB печонидашуда бо спиралҳо дар ивазшавии зидди параллел/параллел ҷойгир шудаанд (расми 2). .5а), 2) банд як чеҳраи секунҷа дорад, ки аз ду спирали дохили баста ва спирали сеюми амудӣ иборат аст (расми майдони асосии (расми 5в) Мотиви CXXC, ки дар сафедаҳои тиоредоксин монанд аст, маълум аст, ки фаъолият мекунад. ҳамчун сенсори редокс 54,55,56, дар ҳоле ки мотив дар аъзоёни оилаи IST метавонад бо изомеразаҳои дисульфиди сафеда ба монанди ERp57 дар синтези гаметаҳо алоқаманд бошад.. Нақшҳо алоқаманданд 57,58.
Аъзоёни супероилаи IST бо се хусусияти хоси домени 4HB муайян карда мешаванд: чор спирал, ки байни самти параллелӣ ва зиддипараллӣ иваз мешаванд, чеҳраҳои бастаи спиралии ба-секунҷа ва як мотиви дукаратаи CXXC, ки дар байни молекулаҳои хурд ба вуҷуд омадаанд.) Спиральҳои N-терминалӣ (норанҷӣ) ва минтақаи ҳалқаи β-мӯй (сабз).
Бо назардошти шабоҳати байни SPACA6 ва IZUMO1, қобилияти пайвастшавӣ ба IZUMO1 ё JUNO санҷида шуд.Интерферометрияи биоқабат (BLI) як усули ҳатмии кинетикӣ мебошад, ки қаблан барои муайян кардани таъсири мутақобилаи IZUMO1 ва JUNO истифода мешуд.Пас аз инкубатсия кардани сенсори тамғагузори биотин бо IZUMO1 ҳамчун дом бо консентратсияи баланди таҳлили JUNO, сигнали қавӣ муайян карда шуд (расми S14a), ки тағирёбии ғафсии биоматериали ба нӯги сенсор пайвастшударо нишон медиҳад.Сигналҳои шабеҳ (яъне, JUNO ба сенсор ҳамчун дом бар зидди таҳлилгари IZUMO1 пайваст карда шудааст) (расми S14b).Вақте ки SPACA6 ҳамчун таҳлилгар бар зидди сенсори IZUMO1 ё JUNO-и сенсор вобаста истифода шудааст, ягон сигнал муайян карда нашуд (Тасвири S14a,b).Набудани ин сигнал нишон медиҳад, ки домени берун аз ҳуҷайравии SPACA6 бо домени берун аз ҳуҷайравии IZUMO1 ё JUNO мутақобила намекунад.
Азбаски таҳлили BLI ба биотинилизатсияи пасмондаҳои лизини озод дар сафедаи дом асос ёфтааст, ин тағирот метавонад пайвастшавиро пешгирӣ кунад, агар пасмондаҳои лизин дар ҳамкорӣ иштирок кунанд.Илова бар ин, самти пайвастшавӣ нисбат ба сенсор метавонад монеаҳои стерикӣ эҷод кунад, аз ин рӯ таҳлилҳои анъанавии поёноб низ дар эктодоменҳои рекомбинати SPACA6, IZUMO1 ва JUNO анҷом дода шуданд.Бо вуҷуди ин, SPACA6 бо IZUMO1 ё JUNO-и барҷастаи Ӯ (расми S14c,d) борид, ки ҳеҷ гуна таъсири мутақобилаеро, ки дар таҷрибаҳои BLI мушоҳида шудааст, нишон медиҳад.Ҳамчун назорати мусбӣ, мо ҳамкории JUNO-ро бо нишони IZUMO1 тасдиқ кардем (Рақмҳои S14e ва S15).
Сарфи назар аз шабоҳати сохтории байни SPACA6 ва IZUMO1, натавонистани SPACA6 барои пайваст кардани JUNO тааҷҷубовар нест.Сатҳи IZUMO1-и инсон зиёда аз 20 пасмондаҳое дорад, ки бо JUNO мутақобила мекунанд, аз ҷумла боқимондаҳои ҳар як аз се минтақа (ҳарчанд аксари онҳо дар минтақаи ҳалқа ҷойгиранд) (расми S14f).Аз ин пасмондаҳо танҳо яктоаш дар SPACA6 (Glu70) нигоҳ дошта мешавад.Дар ҳоле ки бисёр ивазкуниҳои боқимонда хосиятҳои биохимиявии аслии худро нигоҳ медоштанд, пасмондаи муҳими Arg160 дар IZUMO1 бо Asp148-и манфии заряднок дар SPACA6 иваз карда шуд;Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки мутатсияи Arg160Glu дар IZUMO1 пайвастшавӣ ба JUNO43-ро қариб комилан бекор мекунад.Илова бар ин, фарқияти самти домен байни IZUMO1 ва SPACA6 майдони сатҳи макони пайвасти JUNO-и минтақаи эквивалентиро дар SPACA6 ба таври назаррас афзоиш дод (расми S14g).
Сарфи назар аз эҳтиёҷоти маълуми SPACA6 барои синтези гаметаҳо ва шабоҳати он ба IZUMO1, SPACA6 вазифаи муодили ҳатмии JUNO надорад.Аз ин рӯ, мо кӯшиш кардем, ки маълумоти сохтории худро бо далелҳои аҳамияти биологияи эволютсионӣ муттаҳид кунем.Ҳамоҳангсозии пайдарпайи гомологҳои SPACA6 нигоҳдории сохтори умумиро берун аз ширхӯрон нишон медиҳад.Масалан, пасмондаҳои систеин ҳатто дар амфибияҳои дурдаст мавҷуданд (расми 6а).Бо истифода аз сервери ConSurf, маълумот оид ба нигоҳдории пайдарпайии сершумори 66 пайдарпаӣ ба сатҳи SPACA6 харита карда шуд.Ин намуди таҳлил метавонад нишон диҳад, ки кадом пасмондаҳо ҳангоми эволютсияи сафедаҳо ҳифз шудаанд ва нишон медиҳанд, ки кадом минтақаҳои рӯизаминӣ дар функсия нақш мебозанд.
Ҳамоҳангсозии пайдарпайи эктодоменҳои SPACA6 аз 12 намуди гуногун, ки бо истифода аз CLUSTAL OMEGA омода карда шудаанд.Тибқи таҳлили ConSurf, мавқеъҳои консервативӣ бо ранги кабуд нишон дода шудаанд.Боқимондаҳои систеин бо сурх нишон дода шудаанд.Сарҳадҳои домен ва унсурҳои сохтори дуюмдараҷа дар болои ҳамоҳангӣ нишон дода шудаанд, ки дар он тирҳо β-риштаҳоро нишон медиҳанд ва мавҷҳо чархҳоро нишон медиҳанд.Идентификаторҳои дастрасии NCBI, ки пайдарпайҳо доранд, инҳоянд: инсон (Homo sapiens, NP_001303901), мандрилл (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), маймуни капучин (Cebus mimic, XP_017359366), аспи бол (Equcinle, XP_017359366), мо orca3_23 XP_032_034).), гӯсфанд (Ovis aries, XP_014955560), фил (Loxodonta africana, XP_010585293), саг (Canis lupus familyis, XP_025277208), муш (Mus musculus, NP_001156381), Tasman_1156381 318), Платипус, 8) , 61_89 ва Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Рақамгузорӣ ба фармоиши инсон асос ёфтааст.б Намоиши рӯизаминии сохтори SPACA6 бо 4HB дар боло ва домени монанд ба Ig дар поён, рангҳо дар асоси ҳисобҳои ҳифз аз сервери ConSurf.Қисмҳои беҳтарин нигоҳ дошташуда бо ранги кабуд, қисмҳои миёна нигоҳ дошташуда бо ранги сафед ва камтар нигоҳ дошташуда бо ранги зард мебошанд.систеини арғувон.Се часпҳои рӯизаминӣ, ки сатҳи баланди муҳофизатро нишон медиҳанд, дар часпакҳои 1, 2 ва 3 бо нишонгузорӣ нишон дода шудаанд. Мультфилми 4HB дар қисми рости боло нишон дода шудааст (як схемаи ранг).
Сохтори SPACA6 дорои се минтақаи сатҳи хеле ҳифзшуда мебошад (расми 6б).Ямоқи 1 4HB ва минтақаи ҳалқаро дар бар мегирад ва дорои ду пули ҳифзшудаи дисульфиди CXXC, шабакаи ҳалқаи Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (расми S7) ва се пасмондаҳои хушбӯйи берунии ҳифзшуда (Phe31, Tyr73, Phe137) мебошад.як канори васеътари домени Ig монанд (расми S6e), ки якчанд пасмондаҳои заряди мусбатро дар сатҳи нутфа ифода мекунад.Ҷолиб он аст, ки ин часпак дорои эпитопи антитело мебошад, ки қаблан нишон дода шуда буд, ки ба функсияи SPACA6 30 халал мерасонад.Минтақаи 3 ҳалқа ва як тарафи домени ба Ig монандро фаро мегирад;ин минтақа дорои пролинҳои ҳифзшуда (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ва пасмондаҳои қутбӣ/зарядшуда ба берун нигаронида шудаанд.Тааҷҷубовар аст, ки аксари пасмондаҳо дар сатҳи 4HB хеле тағйирёбанда мебошанд (расми 6б), гарчанде ки қабат дар тамоми гомологи SPACA6 (чунон ки аз ҷониби консерватизми ядрои гидрофобӣ нишон дода шудааст) ва берун аз суперфамилияи IST нигоҳ дошта мешавад.
Гарчанде ки ин минтақаи хурдтарин дар SPACA6 бо камтарин унсурҳои сохтори дуюмдараҷаи ошкоршаванда аст, бисёр боқимондаҳои минтақаи ҳалқа (аз ҷумла минтақаи 3) дар байни гомологҳои SPACA6 хеле ҳифз шудаанд, ки ин метавонад нишон диҳад, ки самти бастаи чархзанӣ ва β-сэндвич нақш мебозад.хамчун консерватор.Бо вуҷуди ин, сарфи назар аз пайвастагии густурдаи гидроген ва шабакаҳои электростатикӣ дар минтақаи ҳалқаи SPACA6 ва IZUMO1, далели чандирии дохилиро дар ҳамоҳангсозии сохторҳои сершумори иҷозатдодашудаи IZUMO137,43,44 дидан мумкин аст.Ҳамоҳангсозии доменҳои инфиродӣ хуб ба ҳам мепайвандад, аммо ориентацияи доменҳо нисбат ба ҳамдигар аз меҳвари марказӣ аз 50° то 70° фарқ мекард (расми S16).Барои фаҳмидани динамикаи конформатсияи SPACA6 дар маҳлул, таҷрибаҳои SAXS гузаронида шуданд (расми S17a,b).Таҷдиди Ab initio ectodomain SPACA6 ба сохтори булӯр асои (расми S18) мувофиқат, гарчанде ки қитъаи Кратки як дараҷа чандирии нишон дод (расми S17b).Ин мувофиқат бо IZUMO1 фарқ мекунад, ки дар он сафедаи нопайдошуда ҳам дар тор ва ҳам дар маҳлул шакли бумерангро мегирад43.
Барои мушаххас муайян кардани минтақаи чандир, спектроскопияи массаи мубодилаи гидроген-дейтерий (H-DXMS) дар SPACA6 гузаронида шуд ва бо маълумоти қаблан дар IZUMO143 гирифташуда муқоиса карда шуд (расми 7а, б).SPACA6 нисбат ба IZUMO1 равшантар чандиртар аст, ки ин аз мубодилаи баландтари дейтерий дар тамоми сохтор пас аз 100 000 с мубодила шаҳодат медиҳад.Дар ҳарду сохтор, қисми C-терминали минтақаи ҳалқа сатҳи баланди мубодиларо нишон медиҳад, ки эҳтимолан гардиши маҳдуди доменҳои 4HB ва Ig-ро нисбат ба ҳамдигар имкон медиҳад.Ҷолиб он аст, ки қисми C-терминали ҳалқаи SPACA6, ки аз боқимондаи 147CDLPLDCP154 иборат аст, як минтақаи хеле ҳифзшуда 3 мебошад (расми 6б), эҳтимолан нишон медиҳад, ки чандирии байнидоменӣ як хусусияти эволютсионии ҳифзшудаи SPACA6 мебошад.Тибқи таҳлили чандирӣ, маълумоти обшавии гармии CD нишон дод, ки SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) нисбат ба IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) устувортар аст (расми S1e ва S19).
як тасвирҳои H-DXMS аз SPACA6 ва б IZUMO1.Мубодилаи фоизи дейтерий дар нуктахои вацти нишондодашуда муайян карда шуд.Сатҳи мубодилаи гидроген-дейтерий бо ранг дар миқёси градиент аз кабуд (10%) то сурх (90%) нишон дода мешавад.Қуттиҳои сиёҳ минтақаҳои мубодилаи баландро нишон медиҳанд.Сарҳадҳои 4HB, ҳалқа ва домени монанд ба Ig, ки дар сохтори кристалл мушоҳида мешаванд, дар болои пайдарпаии ибтидоӣ нишон дода шудаанд.Сатҳи мубодилаи дейтерий дар 10 с, 1000 с ва 100 000 с дар диаграммаи тасмае, ки дар сатҳҳои шаффофи молекулавии SPACA6 ва IZUMO1 ҷойгир карда шудааст, тасвир карда шуданд.Қисмҳои сохторҳое, ки сатҳи мубодилаи дейтерий аз 50% камтар аст, ранги сафед доранд.Майдонҳои зиёда аз 50% мубодилаи H-DXMS дар миқёси градиент ранг карда мешаванд.
Истифодаи стратегияҳои генетикии CRISPR/Cas9 ва нокаут генҳои муш боиси муайян кардани якчанд омилҳое гардид, ки барои пайвастшавӣ ва синтези нутфа ва тухм муҳиманд.Ба ғайр аз таъсири мутақобилаи хуб тавсифшудаи сохтори IZUMO1-JUNO ва CD9, аксарияти сафедаҳои марбут ба синтези гаметаҳо аз ҷиҳати сохторӣ ва функсионалӣ мубрам боқӣ мемонанд.Тавсифи биофизикӣ ва сохтории SPACA6 пораи дигари муаммои молекулавии adhesion/fusion ҳангоми бордоршавӣ мебошад.
SPACA6 ва дигар аъзоёни оилаи IST дар ширхӯрон, инчунин паррандагони алоҳида, хазандагон ва амфибияҳо хеле нигоҳ дошта мешаванд;дар асл, чунин мешуморанд, ки SPACA6 ҳатто барои бордоршавӣ дар zebrafish 59 лозим аст. Ин тақсимот ба дигар сафедаҳои маълуми синтези гаметаҳо, ба монанди DCST134, DCST234, FIMP31 ва SOF132 монанд аст, ки ин нишон медиҳад, ки ин омилҳо норасоии HAP2 мебошанд (инчунин бо номи GCS1) сафедаҳо маълуманд, ки барои фаъолияти каталитикии бисёр протистҳо масъуланд., растанӣ ва буғумбурҳо.Протеинҳои синтези бордоршуда 60, 61. Сарфи назар аз шабоҳати қавии сохтории байни SPACA6 ва IZUMO1, нокаут шудани генҳо, ки яке аз ин сафедаҳоро рамзгузорӣ мекунанд, боиси безурётӣ дар мушҳои мардона гардид, ки ин нишон медиҳад, ки вазифаҳои онҳо дар синтези гаметаҳо такрор намешаванд..Ба таври васеъ, ҳеҷ яке аз сафедаҳои маълуми сперма, ки барои марҳилаи пайвастшавии синтез заруранд, зиёдатӣ нест.
Саволи кушода боқӣ мемонад, ки оё SPACA6 (ва дигар аъзоёни супероилаи IST) дар пайвастагиҳои байнигаметикӣ иштирок мекунанд, шабакаҳои дохилигаметикиро ташкил медиҳанд, то сафедаҳои муҳимро ба нуқтаҳои муттаҳидшавӣ ҷалб кунанд ё шояд ҳатто ҳамчун фузогенҳои дастнорас амал кунанд.Таҳқиқоти муштараки иммунопреципиатсия дар ҳуҷайраҳои HEK293T таъсири мутақобилаи байни дарозии пурраи IZUMO1 ва SPACA632-ро ошкор карданд.Бо вуҷуди ин, эктодоменҳои рекомбинатии мо дар in vitro мутақобила накарданд ва аз он шаҳодат медиҳад, ки мутақобила дар Нода ва дигарон дида мешавад.ҳарду дар сохтор нест карда шуданд (ба думи ситоплазмии IZUMO1 таваҷҷӯҳ кунед, ки барои бордоршавӣ нолозим аст62).Интихобан, IZUMO1 ва/ё SPACA6 метавонад муҳитҳои махсуси ҳатмиро талаб кунад, ки мо дар vitro дубора тавлид намекунем, ба монанди конформатсияҳои аз ҷиҳати физиологӣ мушаххас ё комплексҳои молекулавӣ дорои сафедаҳои дигар (маълум ё ҳанӯз кашф нашудаанд).Гарчанде ки эктодомени IZUMO1 миёнаравии пайвастшавии сперматозоидҳоро ба тухм дар фазои перивителлинӣ дорад, ҳадафи эктодомени SPACA6 маълум нест.
Сохтори SPACA6 якчанд сатҳҳои ҳифзшударо ошкор мекунад, ки метавонанд дар таъсири мутақобилаи сафедаҳо ва сафедаҳо иштирок кунанд.Қисмати ҳифзшудаи минтақаи ҳалқа дар наздикии мотиви CXXC (дар боло Ямоқи 1 таъин шудааст) дорои якчанд пасмондаҳои хушбӯй ба берун аст, ки аксар вақт бо таъсири мутақобилаи гидрофобӣ ва π-стекинги байни биомолекулаҳо алоқаманданд.Паҳлӯҳои васеи домени ба Ig монанд (минтақаи 2) як чуқури заряди мусбатро бо боқимондаҳои хеле ҳифзшудаи Arg ва Ӯ ташкил медиҳанд ва антителоҳо бар зидди ин минтақа қаблан барои бастани синтези gamete 30 истифода мешуданд.Антитело эпитопи хаттии 212RIRPAQLTHRGTFS225-ро эътироф мекунад, ки се аз шаш пасмондаҳои аргинин дорад ва His220 хеле ҳифз шудааст.Маълум нест, ки норасоӣ аз бастани ин пасмондаҳои мушаххас ё тамоми минтақа аст.Ҷойгиршавии ин холигоҳ дар наздикии C-терминуси β-сэндвич таъсири cis-ро бо сафедаҳои сперматозоидҳои ҳамсоя нишон медиҳад, аммо на бо сафедаҳои ооцит.Ғайр аз он, нигоҳ доштани як печи хеле чандири аз пролин бой (сайти 3) дар дохили ҳалқа метавонад макони таъсири мутақобилаи сафеда ва сафеда бошад ё эҳтимоли зиёд нигоҳ доштани чандирии байни ду доменро нишон диҳад.Гендер барои нақши номаълуми SPACA6 муҳим аст.омезиши гаметаҳо.
SPACA6 дорои хосиятҳои сафедаҳои пайвастшавии байни ҳуҷайраҳо, аз ҷумла β-сандвичҳои ба Ig монанд аст.Бисёр сафедаҳои часпак (масалан, кадринҳо, интегринҳо, адгезинҳо ва IZUMO1) дорои як ё якчанд доменҳои β-сэндвич мебошанд, ки сафедаҳоро аз мембранаи ҳуҷайра то ҳадафҳои муҳити зисти худ васеъ мекунанд63,64,65.Домени ба Ig шабоҳати SPACA6 инчунин як мотиверо дар бар мегирад, ки маъмулан дар β-сандвичҳои пайвастшавӣ ва пайвастагӣ пайдо мешаванд: дублетҳои риштаҳои параллелӣ дар охири β-сэндвичҳо, ки бо номи тазиқи механикӣ маълуманд66.Гумон меравад, ки ин мотив муқовиматро ба қувваҳои буриш афзоиш медиҳад, ки барои сафедаҳо дар таъсири мутақобилаи байни ҳуҷайраҳо арзишманд аст.Аммо, сарфи назар аз ин монандӣ ба adhesins, дар айни замон ягон далеле вуҷуд надорад, ки SPACA6 бо сафедаҳои тухм мутақобила мекунад.Эктодомени SPACA6 наметавонад ба JUNO пайваст шавад ва ҳуҷайраҳои SPACA6-ро ифодакунандаи HEK293T, тавре ки дар ин ҷо нишон дода шудааст, бо ооцитҳои дорои минтақаи 32 базӯр ҳамкорӣ мекунанд.Агар SPACA6 пайвандҳои байнигаметикӣ барқарор кунад, ин таъсирҳо метавонанд тағироти пас аз трансляцияро талаб кунанд ё аз ҷониби дигар сафедаҳои нутфа устувор карда шаванд.Барои тасдиқи фарзияи охирин, сперматозоидҳои норасоии IZUMO1 ба ооситҳо пайваст мешаванд ва нишон медиҳанд, ки молекулаҳои ғайр аз IZUMO1 дар қадами пайвастшавии гамета 27 иштирок мекунанд.
Бисёре аз протеинҳои синтези вирусӣ, ҳуҷайравӣ ва рушд хосиятҳое доранд, ки вазифаи онҳоро ҳамчун фузогенҳо пешгӯӣ мекунанд.Масалан, гликопротеинҳои синтези вирусӣ (синфҳои I, II ва III) дар охири сафеда, ки ба мембранаи мизбон ворид карда мешаванд, пептид ё ҳалқаи гидрофобӣ доранд.Дар харитаи гидрофилии IZUMO143 ва сохтори (муайян ва пешгӯии) супероилаи IST ягон пептиди синтези гидрофобиро нишон надоданд.Ҳамин тариқ, агар ягон сафеда дар супероилаи IST ҳамчун фузогенҳо амал кунанд, онҳо ин корро ба тарзе аз дигар мисолҳои маълум иҷро мекунанд.
Хулоса, функсияҳои аъзои суперфамилияи IST сафедаҳои марбут ба синтези гаметаҳо як сирри ҷолиб боқӣ мемонанд.Молекулаи рекомбинатии тавсифшудаи SPACA6 ва сохтори ҳалшудаи он дар бораи муносибатҳои байни ин сохторҳои муштарак ва нақши онҳо дар пайвастшавӣ ва синтези гаметаҳо фаҳмиш медиҳад.
Пайдарпаии ДНК, ки ба эктодомени пешбинишудаи инсон SPACA6 мувофиқ аст (рақами пайвастшавии NCBI NP_001303901.1; боқимондаҳо 27–246) барои ифода дар ҳуҷайраҳои Drosophila melanogaster S2 бо кодон оптимизатсия карда шуд ва ҳамчун порчаи ген бо пайдарпаии Genomics (Ecofinding) синтез карда шуд., сигнали секретсияи BiP ва 5' ва 3'-и мувофиқ барои клонкунии мустақили ин ген ба вектори ифодаи pMT дар асоси промоутери металлотионеин, ки барои интихоб бо пуромицин (pMT-puro) тағир дода шудааст, анҷом дода мешавад.Вектори pMT-puro макони ҷудошавии тромбинро рамзгузорӣ мекунад ва пас аз он теги 10x-His C-терминали (Расми S2).
Трансфексияи устувори вектори SPACA6 pMT-puro ба ҳуҷайраҳои D. melanogaster S2 (Gibco) ба монанди протоколе, ки барои IZUMO1 ва JUNO43 истифода шудааст, иҷро карда шуд.Ҳуҷайраҳои S2 об карда шуданд ва дар муҳити Шнайдер (Гибко) парвариш карда шуданд, ки бо консентратсияи ниҳоии 10% (в/в) зардоби гӯсолаи ҳомила бо гармии ғайрифаъолшуда (Гибко) ва антибиотики 1X антимикотикӣ (Гибко) илова карда шуданд.Ҳуҷайраҳои гузариши барвақт (3,0 x 106 ҳуҷайра) дар чоҳҳои алоҳидаи плитаҳои 6-чоҳ (Корнинг) ҷойгир карда шуданд.Пас аз 24 соати инкубатсия дар 27°C, ҳуҷайраҳо тибқи протоколи истеҳсолкунанда бо омехтаи 2 мг вектори SPACA6 pMT-puro ва реагенти трансфексияи Effectene (Qiagen) трансфексия карда шуданд.Ҳуҷайраҳои трансфексияшуда барои 72 соат инкубатсия карда шуданд ва сипас бо 6 мг / мл пуромицин ҷамъоварӣ карда шуданд.Пас аз он ҳуҷайраҳо аз муҳити пурраи Шнайдер ҷудо карда шуданд ва барои истеҳсоли миқёси калон сафеда дар муҳити озод Insect-XPRESS (Lonza) ҷойгир карда шуданд.Як партови 1 л фарҳанги ҳуҷайраҳои S2 то 8-10 × 106 мл-1 ҳуҷайраҳо дар як колбачаи вентилятсияи полипропиленӣ бо қаъри 2 литр парвариш карда шуд ва сипас бо консентратсияи ниҳоии 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) стерилизатсия карда шуд ва стерилизатсияшуда филтр карда шуд.ба вуҷуд овардааст.Фарҳангҳои индуксияшуда дар 27 ° C дар 120 чархзанӣ барои чор рӯз инкубатсия карда шуданд.
Муҳити шартие, ки дорои SPACA6 мебошад, тавассути центрифуга дар 5660 × г дар 4 ° C ва пас аз он системаи филтратсияи тангенсиалии Centramate (Pall Corp) бо мембранаи 10 кДа MWCO ҷудо карда шуд.Ба сутуни қатрони агарозии 2 мл Ni-NTA (Qiagen) муҳити консентратсиони дорои SPACA6-ро истифода баред.Қатрони Ni-NTA бо 10 ҳаҷми сутуни (CV) буфери А шуста шуд ва сипас 1 CV буфери А илова карда шуд, то консентратсияи ниҳоии имидазол 50 мМ дода шавад.SPACA6 бо 10 мл буфери А, ки бо имидазол илова карда шудааст, то консентратсияи ниҳоии 500 мМ элюта карда шуд.Тромбини синфи маҳдудкунанда (Millipore Sigma) мустақиман ба қубури диализ (MWCO 12-14 kDa) дар 1 воҳид ба як мг SPACA6 бар зидди 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 ва 150 mM NaCl (буфери В) барои диализ илова карда шуд.) дар ҳарорати 4°С 48 соат.Сипас SPACA6-и аз тромбин ҷудошуда барои кам кардани консентратсияи намак се маротиба маҳлул карда шуд ва ба сутуни мубодилаи катионҳои 1 мл MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) бор карда шуд, ки бо 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 мувозинат карда шудааст.Катионализатор бо 3 CV аз 10 мм Tris-HCl, pH 7,5 шуста шуд, сипас SPACA6 бо градиенти хаттии 0 то 500 mM NaCl дар 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 барои 25 CV шуста шуд.Пас аз хроматографияи мубодилаи ионҳо, SPACA6 то 1 мл тамаркуз карда шуд ва ба таври изократикӣ аз сутуни ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) бо буфери B мувозинат карда шуд. Мувофиқи хроматограмма, ҳавз ва фраксияҳои консентратӣ дорои SPACA6.Покӣ тавассути электрофорези оғушташудаи Кумасси дар гели 16% SDS-полиакриламид назорат карда шуд.Консентратсияи сафеда бо роҳи абсорбенс дар 280 нм бо истифода аз қонуни Бер-Ламберт ва коэффисиенти назариявии нобудшавии молярӣ муайян карда шуд.
SPACA6-и тозашуда дар як шабонарӯз бар зидди фосфати натрийи 10 mM, pH 7.4 ва 150 mM NaF диализ карда шуд ва пеш аз таҳлил тавассути спектроскопияи CD то 0.16 мг / мл маҳлул карда шуд.Сканкунии спектралии CD-ҳо бо дарозии мавҷи аз 185 то 260 нм дар спектрополяриметри Jasco J-1500 бо истифода аз кюветҳои кварцӣ бо дарозии роҳи оптикии 1 мм (Helma) дар 25°С бо суръати 50 нм/дақ ҷамъоварӣ карда шуд.Спектрҳои CD дар сатҳи ибтидоӣ ислоҳ карда шуданд, ба ҳисоби миёна зиёда аз 10 ба даст оварда шуданд ва ба эллиптсияи миёнаи боқимонда (θMRE) бо дараҷаҳои см2/дмол табдил ёфтанд:
ки дар он МВ вазни молекулавии хар як намуна дар Да;N - шумораи аминокислотаҳо;θ - эллиптӣ дар миллиградаҳо;d ба дарозии роҳи оптикӣ бо см мувофиқат мекунад;консентратсияи сафеда дар воҳидҳо.