347 12,7 * 1,24 мм қубури печонидашудаи аз пӯлоди зангногир, Механизми молекулавии конденсатсияи электростатикии синхронӣ ва коагрегатсияи α-синуклеин ва тау

Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Слайдерҳо се мақоларо дар як слайд нишон медиҳанд.Барои гузаштан дар слайдҳо тугмаҳои қафо ва ояндаро истифода баред ё тугмаҳои контролери слайдро дар охири ҳар як слайд ҳаракат кунед.

347 Мушаххасоти қубур аз пӯлоди зангногир

347 12,7 * 1,24мм аз пӯлоди зангногир қубурҳои печонидашуда

Диаметри берунӣ: 6.00 мм OD то 914.4 мм OD, Андозаҳо то 24 "НБ мавҷуд дар саҳҳомӣ, қубурҳои пӯлоди Андозаи OD дастрас Ex-stock

Диапазони ғафсии қубур SS 347: 0,3мм – 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
ВТ: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S ва ғайра (0,5-12мм) Ё андозаи ғайримуқаррарӣ бояд мувофиқи зарурат мутобиқ карда шавад

Намуди: SS 347 қубурҳои бефосила |Қубурҳои SS 347 ERW |SS 347 Қубурҳои кафшершуда |SS 347 қубурҳои сохташуда |SS 347 найҳои CDW, қубурҳои LSAW / дарз кафшер / аз нав кашидан

Шакл: SS 347 қубурҳои мудаввар/ қубурҳо, SS 347 қубурҳои мураббаъ/ қубурҳо, SS 347 қубурҳои росткунҷа/қубурҳо, SS 347 қубурҳои печонидашуда, шакли SS 347 “U”, SS 347 печкаҳои торт, SS 347 гидравликӣ

Дарозӣ: Як тасодуфӣ, Дучандон тасодуфӣ ва Анҷоми дарозии ҳатмӣ: Охири ҳамвор, канори ҳамвор, поймолшуда

Муҳофизати ниҳоӣ: Сарпӯшҳои пластикӣ |Анҷомдиҳии берунӣ: 2B, №4, №1, №8 Анҷомдиҳии оина барои қубурҳои аз пӯлоди зангногир, ба итмом расонидани мувофиқи талаботи муштарӣ

Шароити таҳвил: ҷӯшоншуда ва бодирингшуда, сайқалонидашуда, нури тозашуда, хунук кашидашуда

Санҷиш, Ҳисоботҳои санҷиш: Шаҳодатномаҳои санҷиши фабрика, EN 10204 3.1, Ҳисоботи химиявӣ, Ҳисоботи механикӣ, Ҳисоботҳои санҷиши PMI, Ҳисобот оид ба санҷиши визуалӣ, Ҳисобот оид ба санҷиши тарафи сеюм, Ҳисоботи лабораторияи тасдиқшудаи NABL, Ҳисоботи санҷиши харобиовар, Ҳисоботи санҷиши вайроннашаванда

Бастабандӣ: Дар қуттиҳои чӯбӣ, халтаҳои пластикӣ, тасмаҳои пӯлодӣ бастабандӣ ё мувофиқи дархости муштариён

Хусусиятҳо: Андозаҳо ва мушаххасоти ғайр аз боло метавонанд тибқи дархост истеҳсол карда шаванд

Диапазони андозаи қубур SS 347: 1/2 дюйм NB, OD то 24 дюйм

ASTM A312 347: Қубури аустенитӣ кафшери бефосила ва рост дарз, ки барои ҳарорати баланд ва хидматрасонии умумии зангзананда пешбинӣ шудааст.Ҳангоми кафшер металли пуркунанда иҷозат дода намешавад.

ASTM A358 347: Қубури аустенитикии кафшери электрикӣ барои хидматрасонии зангзананда ва/ё ҳарорати баланд.Одатан танҳо қубури то 8 дюйм ба ин мушаххасот истеҳсол карда мешавад.Ҳангоми кафшер илова кардани металли пуркунанда иҷозат дода мешавад.

ASTM A790 347: Қубури бефосила ва рости кафшери ферритикӣ/устенитикӣ (дуплекс) барои хидматрасонии умумии зангзананда бо таваҷҷӯҳи махсус ба муқовимат ба крекинги зангзании стресс пешбинӣ шудааст.

ASTM A409 347: Омехтаи электрикии дарзҳои рост ё спиралӣ бо кафшери қубури девори сабуки аустенитии диаметри калон аз андозаи 14 "то 30" бо деворҳои Sch5S ва Sch 10S барои зангзананда ва / ё баланд

ASTM A376 347: Қубури бефосилаи аустенитӣ барои барномаҳои ҳарорати баланд.

ASTM A813 347: Қубури аустенитикии якқабата, як ё дукарата кафшершуда барои ҳарорати баланд ва барномаҳои зангзании умумӣ.

ASTM A814 347: Қубури аустенитикии кафшершудаи хунук барои ҳарорати баланд ва хидматрасонии умумии зангзананда.

347H қубурҳои аз пӯлоди зангногир таркиби кимиёвӣ

Хусусиятҳои механикии пӯлоди зангногир 347H қубур

Пӯлоди зангногир 347H қубурҳо хосиятҳои физикӣ

Баҳои баробар барои қубури аз пӯлоди зангногир 347H

Агрегатсияи амилоид алфа-синуклеин (αS) аломати хоси бемории Паркинсон ва дигар синуклеинопатияҳо мебошад.Ба наздикӣ, протеини tau, ки маъмулан бо бемории Алтсгеймер алоқаманд аст, бо патологияи αS алоқаманд буд ва дар таркиби αS бойи ҳамҷойшавӣ пайдо шуд, гарчанде механизми молекулавии коагрегатсияи ду сафеда норавшан боқӣ мемонад.Мо дар ин ҷо хабар медиҳем, ки марҳилаи αS ба конденсатҳои моеъ тавассути конденсатсияи комплексии электростатикӣ бо полипептидҳои мусбат заряднок ба монанди tau ҷудо мешавад.Вобаста аз наздикии αS ба поликатионҳо ва суръати камшавии валентии шабакаи коагулятсия, лахтаҳо зуд гелатсия ё муттаҳид мешаванд ва пас аз ҷамъшавии сусти амилоидҳо.Бо омезиши маҷмӯи усулҳои пешрафтаи биофизикӣ, мо тавонистем ҷудошавии фазаи моеъ-моеъи αS/Tau-ро тавсиф кунем ва омилҳои асосиро муайян кунем, ки ба ташаккули агрегатҳои гетерогении дорои ҳарду сафедаҳо дар конденсати сафедаи моеъ оварда мерасонанд.
Илова ба қисмҳои мембрана, ҷудошавии фазоӣ дар ҳуҷайраҳо инчунин тавассути ташаккули ҷисмҳои зиччи аз сафеда бой ва моеъ монанд ба номи конденсатҳои биомолекулярӣ ё қатраҳо тавассути раванде, ки бо номи ҷудошавии фазаи моеъ-моеъ (LLPS) маълум аст, ба даст оварда мешавад.Ин қатраҳо дар натиҷаи таъсири мутақобилаи бисёрваленти муваққатӣ, одатан байни сафедаҳо ё сафедаҳо ва РНК ба вуҷуд меоянд ва тақрибан дар ҳама системаҳои зинда вазифаҳои гуногунро иҷро мекунанд.Миқдори зиёди сафедаҳои қобилияти LLP пайдарпайии мураккабии пастро нишон медиҳанд, ки дар табиат ва ташаккули конденсатҳои биомолекулярӣ хеле бетартибанд3,4,5.Тадқиқотҳои сершумори таҷрибавӣ табиати чандир, аксар вақт бетартиб ва бисёрвалентии сафедаҳоеро, ки ин конденсатҳои моеъро ташкил медиҳанд, ошкор карданд, гарчанде ки дар бораи детерминантҳои мушаххаси молекулавӣ, ки афзоиш ва камолоти ин конденсатҳоро то ба конденсатҳои сахт монанд назорат мекунанд, кам маълум аст. давлат..
Маълумотҳои нав гипотезаро дастгирӣ мекунанд, ки LLPS-и аз протеин асосёфта ва табдил додани қатраҳо ба сохторҳои сахт метавонанд роҳҳои дахлдори ҳуҷайравӣ бошанд, ки ба ташаккули агрегатҳои заҳрноки ҳалнашаванда, ки аксар вақт аломатҳои бемориҳои degenerative мебошанд.Бисёре аз протеинҳои бетартиби бо LLPS (IDPs) алоқаманд, ки аксар вақт пурқувват ва чандир мебошанд, муддати тӯлонӣ бо нейродегенератсия тавассути раванди ҷамъшавии амилоид алоқаманд буданд.Махсусан, конденсатҳои биомолекулярии IDP ба монанди FUS7 ё TDP-438 ё сафедаҳо бо доменҳои мураккаби паст ба монанди hnRNPA19 нишон дода шудаанд, ки тавассути раванде, ки моеъизатсия номида мешавад, ба шаклҳои гел монанд ё ҳатто сахт пир мешаванд.мураккаб.Гузариш ба марҳилаи сахт (LSPT) ҳамчун функсияи вақт ё дар посух ба баъзе тағиротҳои пас аз тарҷума ё мутатсияҳои аз ҷиҳати патологӣ муҳим1,7.
Боз як IDP, ки бо LLPS дар vivo алоқаманд аст, Тау, як протеини вайроншудаи микротубула мебошад, ки ҷамъшавии амилоиди он дар бемории Алтсгеймер алоқаманд аст10, аммо ба наздикӣ дар бемории Паркинсон (PD) ва дигар протеинопатияҳои ядроии синаптикӣ алоқаманд аст 11, 12, 13.Нишон дода шудааст, ки Тау аз маҳлул/ситоплазма аз сабаби таъсири мутақобилаи мусоиди электростатикӣ14 ба таври стихиявӣ ҷудо мешавад, ки дар натиҷа қатраҳои бо tau бойшуда бо номи коацерватҳои электростатикӣ маълум мешаванд.Инчунин мушоҳида шудааст, ки ин намуди мутақобилаи ғайримуқаррарӣ қувваи пешбарандаи бисёр конденсатҳои биомолекулярӣ дар табиат мебошад15.Дар мавриди протеини тоу, агрегатсияи электростатикиро метавон тавассути агрегатсияи оддӣ ташкил дод, ки дар он минтақаҳои зарядноки сафеда раванди ҷудошавиро ба вуҷуд меоранд ё тавассути агрегатсияи мураккаб тавассути ҳамкорӣ бо полимерҳои заряди манфӣ ба монанди РНК.
Ба наздикӣ, α-синуклеин (αS), як IDP амилоид, ки дар PD ва дигар бемориҳои нейродегенеративӣ ба таври дастаҷамъӣ бо номи синуклеинопатия маълум аст17,18, дар моделҳои ҳуҷайравӣ ва ҳайвонот19,20 дар конденсатҳои сафеда бо рафтори моеъ тамаркузшуда нишон дода шудааст.Тадқиқотҳои in vitro нишон доданд, ки αS аз LLPS тавассути агрегатсияи оддӣ тавассути таъсири мутақобилаи асосан гидрофобӣ мегузарад, гарчанде ки ин раванд консентратсияи хеле баланди сафедаҳо ва вақтҳои ғайримуқаррарии инкубатсияро талаб мекунад19,21.Новобаста аз он, ки конденсатҳои дорои αS-и дар vivo мушоҳидашуда тавассути ин ё дигар равандҳои LLPS ташаккул меёбанд, як масъалаи калидии ҳалнашуда боқӣ мемонад.Ба ҳамин монанд, гарчанде ки ҷамъшавии αS амилоид дар нейронҳо дар PD ва дигар синуклеинопатияҳо мушоҳида шудааст, механизми дақиқе, ки тавассути он αS ҷамъшавии амилоиди дохилиҳуҷайраро мегузаронад, норавшан боқӣ мемонад, зеро аз ҳад зиёд экспресссияи ин сафеда ин равандро худ аз худ ба вуҷуд намеорад.Зарари иловагии ҳуҷайравӣ аксар вақт талаб карда мешавад, ки аз он шаҳодат медиҳад, ки ҷойҳои муайяни ҳуҷайра ё муҳити микроэлементҳо барои ренуклеатсияи анҷуманҳои амилоидҳои дохили ҳуҷайраҳои αS заруранд.Як муҳити ҳуҷайра, ки махсусан ба ҷамъшавӣ майл дорад, метавонад дохили конденсатҳои сафеда бошад 23 .
Ҷолиб он аст, ки αS ва tau дар дохилшавии хоси бемориҳо дар одамон бо бемории Паркинсон ва дигар синуклеинопатияҳо якҷоя локализатсия карда шуданд 24,25 ва таҷрибаҳо робитаи синергетикии патологии байни ду сафеда 26,27 гузориш доданд, ки робитаи эҳтимолии байни агрегатсияи αS ва tau дар бемориҳои нейродегенеративӣ.касали.αS ва tau барои мутақобила ва мусоидат ба ҷамъшавии ҳамдигар дар in vitro ва in vivo 28,29 ва агрегатҳои гетерогенӣ, ки аз ин ду сафеда иборатанд, дар майнаи беморони синуклеинопатияҳо 30 мушоҳида карда шуданд.Аммо дар бораи асосҳои молекулавии таъсири мутақобилаи αS ва tau ва механизми якҷояшавии он кам маълум аст.Гузориш шудааст, ки αS бо tau тавассути ҷалби электростатикӣ байни минтақаи хеле манфии C-терминали зарядноки αS ва минтақаи марказии аз пролини бойи tau, ки инчунин бо пасмондаҳои заряди мусбат бой шудааст, ҳамкорӣ мекунад.
Дар ин таҳқиқот, мо нишон медиҳем, ки αS воқеан метавонад ба қатраҳо тавассути конденсатсияи комплексии электростатикӣ дар ҳузури протеини тау, бар хилофи таъсири мутақобилаи он бо дигар полипептидҳои зарядноки мусбат ба монанди поли-L-лизин (pLK) ва дар ин раванд ҷудо шавад.αS ҳамчун як молекулаи устухон барои шабакаи қатраҳо амал мекунад.Мо дар раванди пухта расидани коацерватҳои электростатикии αS фарқиятҳои назаррасро муайян кардем, ки бо фарқияти валентӣ ва қувваи таъсири мутақобилаи сафедаҳое, ки дар шабакаи коацерватҳо иштирок мекунанд, алоқаманданд.Ҷолиб он аст, ки мо якҷояшавии αS ва сафедаҳои амилоидҳои тауро дар коацерватҳои моеъи дарозмуддат мушоҳида кардем ва баъзе омилҳои асосиро муайян кардем, ки ба якҷояшавии ин ду сафеда дар чунин коацерватҳо оварда мерасонанд.Дар ин ҷо мо ин равандро ба таври муфассал тавсиф мекунем, ки механизми эҳтимолии молекулавӣест, ки дар асоси колокализатсияи ду сафеда дар дохилшавии хоси беморӣ ҷойгир аст.
αS дорои думи хеле анионии C-терминали дар рН бетараф аст (расми 1а) ва мо фарзия кардем, ки он метавонад тавассути конденсатсияи комплексҳои электростатикӣ бо молекулаҳои полипептидҳои бетартиби поликатионӣ LLPS гузарад.Мо як молекулаи модели ибтидоии 100-боқимондаи поли-Л-лизинро (pLK) истифода бурдем, зеро табиати полимерии мусбат заряднок ва бетартиби он дар рН 32 бетараф аст. Аввалан, мо тасдиқ кардем, ки pLK бо домени Ct аз αS тавассути спектроскопияи Solution NMR ҳамкорӣ мекунад. (Расми 1б) бо истифода аз αS-и 13C/15N дар ҳузури афзоиши таносуби молярии αS: pLK.Таъсири мутақобилаи pLK бо Ct-домени αS дар вайроншавии тағирёбии кимиёвӣ ва паст шудани шиддатнокии баланд дар ин минтақаи сафеда зоҳир мешавад.Ҷолиб он аст, ки вақте ки мо αS-ро бо pLK дар консентратсияи αS тақрибан омехта кардем.5–25 мкМ дар ҳузури полиэтиленгликол (5–15% PEG-8) (буфери маъмулии LLPS: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) мо фавран аз майдони васеи ташаккули сафеда гузаштем. .қатраҳо бо истифода аз микроскопияи флуоресцентӣ (WF) ва майдони равшан (BF) мушоҳида карда шуданд (расми 1в).Қатраҳои 1-5 мкм дорои консентратсияи αS (иловашуда 1 мкМ AlexaFluor488-маркази αS, AF488-αS), хосиятҳои электростатикии онҳоро метавон аз муқовимати онҳо ба 10% 1,6-гександиол (1,6-HD) ва ҳассосияти он ба афзоиши консентратсияи NaCl (расми 1в).Моеъ монанд будани коацерватҳои комплекси электростатикии αS/pLK бо қобилияти муттаҳидшавӣ дар давоми миллисонияҳо нишон дода мешавад (расми 1г).Бо истифода аз турбидиметрия, мо ташаккули қатраҳоро дар ин шароитҳо муайян кардем, табиати электростатикии мутақобилаи асосиро, ки бо устувории он алоқаманд аст, тасдиқ кардем (расми 1е) ва таъсири таносуби гуногуни полимерҳоро ба раванди LLPS арзёбӣ кардем (расми 1f).Гарчанде ки ташаккули қатраҳо дар доираи васеи таносуби полимерҳо мушоҳида мешавад, раванд ҳангоми аз αS зиёд будани pLK хеле мусоид аст.ҶДММ инчунин бо истифода аз агенти аз ҷиҳати кимиёвии ивазкунандаи декстран-70 (70 кДа) ё бо истифода аз форматҳои гуногуни намунаҳо, аз ҷумла қатраҳои слайдҳои шишагӣ, чоҳҳои микроплитаҳои маводи гуногун, капиллярҳои Эппендорф ё кварц мушоҳида карда шудаанд.
Намояндагии схематикии минтақаҳои гуногуни сафеда дар вариантҳои WT-αS ва ΔCt-αS, ки дар ин таҳқиқот истифода мешаванд.Домени амфипатикии N-терминал, минтақаи гидрофоби амилоид-созанда (NAC) ва домени C-терминали манфии заряднок мутаносибан бо рангҳои кабуд, норанҷӣ ва сурх нишон дода шудаанд.Харитаи пардохти холис барои як боқимонда (NCPR)-и WT-αS нишон дода шудааст.б Таҳлили NMR таъсири мутақобилаи αS / pLK дар сурати мавҷуд набудани блокҳои макромолекулярӣ.Бо зиёд шудани консентратсияи pLK (таносуби молярии αS: pLK 1:0,5, 1:1,5 ва 1:10 мутаносибан бо сабзи равшан, сабз ва торик сабз нишон дода шудаанд).c Коасерват кардани αS/pLK (таносуби молярӣ 1:10) дар 25 мкМ (1 μM αS бо нишони AF488 ё pLK бо Atto647N барои тасвири WF) дар буфери LLPS (боло) ё бо 500 mM NaCl ё баъд аз чап (поён10) % 1,6-гександиол (1,6-HD; поёни рост).Сатри миқёс = 20 мкм.г Тасвирҳои микроскопии намояндагии омезиши қатраҳои BF аз αS/pLK (таносуби молярӣ 1:10) дар консентратсияи 25 μM;тирчаҳо якҷояшавии қатраҳои алоҳидаро (тирчаҳои сурх ва зард) ба қатраи нав (тирчаи норанҷӣ) дар давоми 200 мс нишон медиҳанд.Сатри миқёс = 20 мкм.e Парокандашавии рӯшноӣ (дар 350 нм) ҷамъшавии αS/pLK дар буфери LLPS пеш аз ва баъд аз илова кардани 500 mM NaCl ё 10% 1,6-HD дар 25 μM αS (N = 3 такрори намуна, инҳирофи миёна ва стандартӣ низ нишон дода шудааст).f Тасвири BF (боло) ва таҳлили парокандашавии рӯшноӣ (дар 350 нм, поён) ҷамъшавии αS/pLK дар 25 μM αS бо афзоиши таносуби молярии αS: pLK (N = 3 такрори намуна, инҳирофоти миёна ва стандартӣ низ нишон дода шудааст).Сатри миқёс = 10 мкм.Сатри миқёс дар як тасвир миқёси ҳамаи тасвирҳоро дар як панел нишон медиҳад.Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумоти хом пешниҳод карда мешавад.
Дар асоси мушоҳидаҳои мо дар бораи конденсатсияи комплексии электростатикии αS/pLK ва мушоҳидаҳои қаблии αS ҳамчун молекулаи муштарии конденсати tau/RNA тавассути таъсири мустақим бо tau31, мо фарзия кардем, ки αS ва tau дар сурати набудани РНК метавонанд бо ҳалкунанда якҷоя ҷудо шаванд. конденсация.тавассути комплексҳои электростатикӣ ва αS протеини устухон дар коацерватҳои αS/Tau мебошад (ниг. тақсимоти заряди tau дар расми 2e).Мо мушоҳида кардем, ки вақте ки 10 μM αS ва 10 μM Tau441 (дар таркиби 1 μM AF488-αS ва 1 μM Atto647N-Tau мутаносибан) дар буфери LLPS якҷоя омехта шуданд, онҳо ба осонӣ агрегатҳои сафедаеро, ки дорои ҳарду сафеда мебошанд, ба вуҷуд оварданд, тавре ки аз ҷониби микроскопияи WF дида мешавад.(расми 2а).Коллокализатсияи ду сафеда дар қатраҳо бо микроскопияи конфокалӣ (CF) тасдиқ карда шуд (Расми 1а).Рафтори шабеҳ ҳангоми истифодаи декстран-70 ҳамчун агенти ҷамъоварӣ мушоҳида карда шуд (Расми иловагӣ 1c).Бо истифода аз PEG бо нишони FITC ё декстран, мо дарёфтем, ки ҳарду агентҳои пурбор дар байни намунаҳо баробар тақсим шудаанд, ки на сегрегатсия ва на ассотсиатсияро нишон намедиҳанд (Расми иловагӣ 1d).Баръакс, он аз он шаҳодат медиҳад, ки дар ин система онҳо ҷудошавии фазаҳоро тавассути таъсироти макромолекулярӣ мусоидат мекунанд, зеро PEG як агенти бартарии устувори издиҳом аст, тавре ки дар дигар системаҳои LLP33,34 дида мешавад.Ин қатраҳои аз сафеда бой ба NaCl (1 М) ҳассос буданд, аммо на ба 1,6-HD (10% v/v), хосиятҳои электростатикии онҳоро тасдиқ мекунанд (Расми 2а, б).Рафтори моеъи онҳо тавассути мушоҳидаи ҳодисаҳои миллисония бо истифода аз микроскопияи BF тасдиқ карда шуд (расми 2б).
Тасвирҳои микроскопии конфокалӣ (CF) аз коасерватҳои αS/Tau441 дар буфери LLPS (10 мкМ ҳар як сафеда, 0,5 мкм аз αS-и AF488 ва Atto647N бо тамғаи Tau441).б Тасвирҳои контрасти дифференсиалии интерференсиалӣ (DIC) ҳодисаҳои синтези қатраҳои αS/Tau441 (барои ҳар як сафеда 10 мкм).в Диаграммаи марҳилавӣ дар асоси парокандашавии рӯшноӣ (дар 350 нм) аз Tau441 LLPS (0–15 μM) дар набудани (чап) ё мавҷудияти (аз рост) 50 μM αS.Рангҳои гармтар парокандашавии бештарро нишон медиҳанд.d Парокандашавии нури намунаҳои αS/Tau441 LLPS бо афзоиши консентратсияи αS (Tau441 дар 5 μM, N = 2-3 такрори намуна тавре нишон дода шудааст).e Намоиши схематикии баъзе вариантҳои сафедаи тау ва минтақаҳои гуногуни сафеда, ки дар ин тадқиқот истифода мешаванд: домени заряди манфии N-терминал (сурх), минтақаи аз пролин бой (кабуд), домени ҳатмии микротубула (MTBD, бо ранги норанҷӣ таъкид шудааст) ва спирали ҷуфти амилоидсоз.минтақаҳои филаментӣ (PHF) дар дохили MTBD (хокистарӣ) ҷойгиранд.Харитаи Net Charge Per Residue (NCPR) аз Tau441 нишон дода шудааст.f Бо истифода аз 1 μM αS-и AF488 нишонгузорӣ ва ΔNt- бо Atto647N нишонгузорӣ, бо истифода аз 1 μM αS AF488 нишонгузорӣ ё ΔCt-αS дар ҳузури ΔNt-Tau (боло, 10 μM барои як сафеда) ё K18 (поён, дар як μM5 сафеда) ) ) ) микрографҳои WF конденсатсионӣ дар LLPS ё буфери K18.Сутунҳои миқёс дар як тасвир миқёси ҳамаи тасвирҳои як панелро ифода мекунанд (20 микрон барои панелҳои a, b ва f).Маълумоти хом барои панелҳои c ва d ҳамчун файлҳои хоми маълумот пешниҳод карда мешаванд.
Барои санҷидани нақши αS дар ин раванди LLPS, мо аввал таъсири αS-ро ба устувории қатраҳо тавассути нефелометрия бо истифода аз консентратсияи афзояндаи NaCl таҳқиқ кардем (расми 2c).Чӣ қадаре ки консентратсияи намак дар намунаҳои дорои αS зиёд бошад, ҳамон қадар қиматҳои парокандашавии нур баландтар аст (дар 350 нм), ки нақши устуворкунандаи αS-ро дар ин системаи LLPS нишон медиҳад.Таъсири шабеҳро тавассути зиёд кардани консентратсияи αS (ва аз ин рӯ таносуби αS: Tau441) то тақрибан мушоҳида кардан мумкин аст.10 маротиба афзоиш нисбат ба консентратсияи tau (5 мкМ) (расми 2d).Барои нишон додани он, ки αS як протеин дар коасерватҳост, мо тасмим гирифтем, ки рафтори мутант-вайроншудаи Тау-и LLPS-ро, ки минтақаи заряди манфии N-терминали надорад (боқимондаҳои 1-150, ба расми 2e) бо номи ΔNt-Tau, тафтиш кунем.Микроскопияи WF ва нефелометрия тасдиқ кард, ки худи ΔNt-Tau аз LLPS нагузаштааст (расми 2f ва расми иловагӣ 2d), тавре ки қаблан хабар дода шуда буд 14. Аммо, вақте ки αS ба маҳлулҳои дисперсионии ин варианти буридашудаи Tau илова карда шуд, раванди LLPS пурра ба амал омад. бо зичии қатраҳо наздик ба зичии маҳлулҳои андозаи пурраи Tau ва αS дар шароити шабеҳ ва консентратсияи сафедаҳо барқарор карда мешавад.Ин равандро дар шароити камшавии макромолекулаҳо низ мушоҳида кардан мумкин аст (расми иловагӣ 2c).Нақши минтақаи C-терминали αS, аммо на тамоми дарозии он дар раванди LLPS тавассути ҷилавгирӣ аз ташаккули қатраҳо бо истифода аз варианти C-терминали буридашудаи αS, ки боқимондаҳои 104-140 (расми 1а) аз (ΔCt- αS) сафеда (расми 2f ва расми иловагӣ 2d).Коллокализатсияи αS ва ΔNt-Tau бо микроскопияи конфокалии флуоресцентӣ тасдиқ карда шуд (Расми 1b).
Барои санҷиши минбаъдаи механизми LLPS байни Tau441 ва αS, як варианти иловагии Tau истифода шуд, яъне порчаи ҷуфтшудаи ядрои филаменти спиралӣ (PHF) дар домени ҳатмии микротюбула (MTBD), ки агар он дорои чаҳор домени такрории хос, маъмулан маълум бошад. ҳамчун порчаи K18 (ниг. Расми 2e).Ба наздикӣ гузориш дода шудааст, ки αS бартарӣ ба протеини тау, ки дар домени бойи пролин ҷойгир аст, бо пайдарпаӣ, ки пеш аз домени ҳатмии микротубул ҷойгир аст, мепайвандад.Аммо, минтақаи PHF инчунин аз пасмондаҳои зарядноки мусбат бой аст (ниг. ба расми 2e), махсусан лизин (15% пасмондаҳо), ки моро водор кард, ки санҷем, ки оё ин минтақа низ ба конденсатсияи комплекси αS/Tau саҳм мегузорад.Мо мушоҳида кардем, ки танҳо K18 наметавонад LLPS-ро дар консентратсияи то 100 мкм дар шароити озмоишшуда (буфери LLPS бо 15% PEG ё 20% декстран) ба вуҷуд орад (Расми 2f).Аммо, вақте ки мо 50 μM αS ба 50 μM K18 илова кардем, ташаккули босуръати қатраҳои сафеда, ки дорои K18 ва αS мебошанд, тавассути нефелометрия (расми иловагӣ 2d) ва микроскопияи WF (расми 2f) мушоҳида карда шуд.Тавре ки интизор мерафт, ΔCt-αS натавонист рафтори LLPS-и K18-ро барқарор кунад (расми 2f).Мо қайд мекунем, ки ҷамъшавии αS/K18 барои ба вуҷуд овардани LLPS дар муқоиса бо αS/ΔNt-Tau ё αS/Tau441 консентратсияи сафедаҳои каме баландтарро талаб мекунад, ки чизҳои дигар баробаранд.Ин бо ҳамкории қавитари минтақаи αS C-терминалӣ бо домени бойи Тау дар муқоиса бо домени ҳатмии микротубул, тавре ки қаблан 31 тавсиф шуда буд, мувофиқ аст.
Бо назардошти он, ки ΔNt-Tau дар сурати набудани αS LLPS-ро иҷро карда наметавонад, мо ин варианти Tau-ро ҳамчун модел барои тавсифи αS/Tau LLPS бо назардошти соддагии он дар системаҳои LLPS бо дарозии Tau (изотип, Tau441/Tau441) интихоб кардем.бо равандҳои ҷамъшавии мураккаб (гетеротипӣ, αS/Tau441).Мо дараҷаи ҷамъшавии αS (ҳамчун як қисми протеини фазаи конденсатсионӣ, fαS,c) дар системаҳои αS/Tau ва αS/ΔNt-Tau тавассути центрифугакунӣ ва таҳлили фазаи парокандаи SDS-PAGE муқоиса кардем (ниг. 2e), арзишҳои хеле шабеҳро дарёфтем. барои ҳама сафедаҳо дар консентратсияи якхела.Аз ҷумла, мо барои αS/Tau ва αS/ΔNt-Tau мутаносибан fαS,c 84 ± 2% ва 79 ± 7% ба даст овардем, ки ба он ишора мекунад, ки таъсири мутақобилаи гетеротипӣ байни αS ва tau аз таъсири мутақобилаи байни молекулаҳои tau бартарӣ дорад.байни.
Таъсири мутақобила бо поликатсияҳои гуногун ва таъсири раванди конденсатсия ба кинетикаи αS бори аввал тавассути барқарорсозии флуоресцентсия пас аз усули фотосафедкунӣ (FRAP) омӯхта шуд.Мо коасерватҳои αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ва αS/pLK-ро озмоиш кардем (100 μM αS бо 2 μM αS AF488-αS ва 100 μM Tau441 ё ΔNt-Tau ё 1 mM pLK илова карда шудааст).Маълумот дар давоми 30 дақиқаи аввал пас аз омехта кардани ҷузъҳои намуна ба даст оварда шуданд.Аз тасвирҳои намояндагии FRAP (расми 3a, αS/Tau441 конденсатсия) ва каҷҳои мувофиқи ҷараёни вақти онҳо (расми 3b, Расми иловагӣ 3), дидан мумкин аст, ки кинетикаи αS ба аксҳои коацерватҳои Tau441 хеле монанд аст.ва ΔNt-Tau, ки бо pLK хеле тезтар аст.Коэффисиентҳои ҳисобшудаи диффузия барои αS дар дохили коасерват мувофиқи FRAP (тавре ки Канг ва дигарон 35 тавсиф кардааст) D = 0,013 ± 0,009 мкм2/с ва D = 0,026 ± 0,008 мкм2/с барои αS/Tau441 ва α-S/Δt мебошанд. системаи αS/.pLK, Tau ва D = 0,18 ± 0,04 мкм2/с, (расми 3c).Бо вуҷуди ин, коэффисиенти диффузияи αS дар фазаи пароканда аз ҳама фазаҳои конденсатсионӣ чанд дараҷа баландтар аст, тавре ки аз ҷониби Спектроскопияи коррелятсияи флуоресцентӣ (FCS, нигаред ба расми 3) дар як шароит (буфери LLPS), вале дар сурати мавҷуд набудани поликатсияҳо муайян карда мешавад. (D = 8 ± 4 мкм2/с).Аз ин рӯ, кинетикаи тарҷумаи αS дар коацерватҳо нисбат ба сафедаҳо дар марҳилаи пароканда аз сабаби таъсири равшани ҷамъшавии молекулавӣ ба таври назаррас коҳиш меёбад, гарчанде ки ҳама коасерватҳо дар муқоиса бо марҳилаи тау дар давоми ним соати аввали ташаккули онҳо хосиятҳои моеъро нигоҳ медоранд.кинетикаи тезтар дар конденсати pLK.
a–c FRAP таҳлили динамикаи αS (2% AF488 бо нишони αS) дар коацерватҳои электростатикӣ.Тасвирҳои намояндагии таҳлилҳои αS/Tau441 FRAP дар се нусха дар (a) нишон дода шудаанд, ки доираҳои сурх минтақаҳои рангорангро нишон медиҳанд.Сатҳи миқёс 5 микрон аст.б Каҷҳои миёнаи FRAP ва (в) коэффисиентҳои ҳисобшудаи диффузия (D) барои 5–6 (N) қатраҳои гуногун аз се таҷриба бо истифода аз 100 μM αS ва консентратсияи эквимолярии Tau441 (сурх) ё ΔNt-Tau (кабуд) ё pLK (сабз) дар дах баробар концентрациям ЛПС.Инҳирофи стандартии каҷи FRAP бо ранги сояафкан нишон дода шудааст.Барои муқоиса, коэффисиенти диффузияи αS дар марҳилаи пароканда бо истифода аз спектроскопияи коррелятсияи флуоресцентӣ (FCS) дар се нусха муайян карда шуд (барои маълумоти бештар ба расми 3 ва усулҳои иловагӣ нигаред).d Спектрҳои пайвастаи X-банд EPR 100 μM TEMPOL-122-αS дар буфери LLPS бе ягон поликатсия (сиёҳ) ё дар ҳузури 100 μM Tau441 (сурх) ё ΔNt-Tau (кабуд) ё 1 mM pLK (сабз).Вуруд намуди васеъшудаи хатҳои майдони қавӣ, ки дар он тағироти шадидтарин рух медиҳанд, нишон медиҳад.e Каҷҳои ҳатмии 50 μM TEMPOL-122-αS бо поликатсияҳои гуногун дар сурати набудани LLPS (бе PEG).Амплитудаи камшудаи банд III дар муқоиса бо банд II (IIII/III)-и спектри муқарраршудаи EPR барои зиёд кардани таносуби молярии Tau441 (сурх), ΔNt-Tau (кабуд) ва pLK (сабз) нишон дода шудааст.Хатҳои ранга мувофиқатро ба маълумот бо истифода аз модели ҳатмии ноҳамвор бо n сайти ҳатмии якхела ва мустақил дар ҳар як хат нишон медиҳанд.Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумотҳои хом пешниҳод карда мешаванд.
Ҳамчун илова, мо динамикаи αS-ро дар коасерватҳои гуногун бо истифода аз тамғагузории рост (SDSL) ва резонанси пайвастаи парамагнитии электронӣ (CW-EPR) таҳқиқ кардем.Ин усул барои гузориш додани чандирӣ ва динамикаи IDP бо қарори воқеии боқимонда хеле муфид аст36,37,38.Бо ин мақсад, мо боқимондаҳои систеинро дар мутантҳои ягонаи Cys сохтем ва зонди спинии 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL)-ро истифода бурдем.Ҳосилаҳои малеймид онҳоро нишон медиҳанд.Аниқтараш, мо зондҳои TEMPOL дар мавқеи 122 ё 24 αS (TEMPOL-122-αS ва TEMPOL-24-αS) ҷойгир кардем.Дар ҳолати аввал, мо минтақаи C-терминали сафедаро, ки дар ҳамкорӣ бо поликатҳо иштирок мекунад, ҳадаф қарор медиҳем.Ба ҷои ин, мавқеи 24 метавонад ба мо дар бораи динамикаи умумии сафедаҳо дар конденсат маълумот диҳад.Дар ҳарду ҳолат, сигналҳои EPR, ки барои сафедаҳои фазаи пароканда гирифта шудаанд, ба радикалҳои нитроксид дар ҳолати зудҳаракат мувофиқат мекарданд.Пас аз ҷудошавии фаза дар ҳузури tau ё pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ё ΔNt-Tau дар таносуби 1:1 ё pLK дар таносуби 1:10), афзоиши шиддатнокии нисбии авҷи дар спектри EPR аз αS.Хатти талафот васеъ шуд, ки ин нишон медиҳад, ки кинетикаи ориентацияи αS дар қатраҳо дар муқоиса бо протеин дар марҳилаи сустшуда коҳиш ёфтааст (расми 3d, Расми 4а).Ин таѓйиротњо дар мавќеи 122 бештар ба назар мерасанд. Дар њоле ки дар мавќеи 24 мављудияти pLK ба кинетикаи зонд таъсир намерасонд, дар мавќеи 122 шакли хатти спектрї ба таври назаррас таѓйир ёфт (расми иловагии 4а).Вақте ки мо кӯшиш кардем, ки спектрҳоро дар мавқеи 122-и ду системаи αS/поликатсия бо истифода аз модели изотропӣ (Расми 5а), ки маъмулан барои тавсифи динамикаи бо чархи IDP38,39 истифодашаванда истифода мешаванд, модел кунем, мо натавонистем спектрҳои таҷрибавиро барқарор кунем..Моделизатсияи спектралии мавқеи 24 чархзании контраст (расми иловагӣ 5а).Ин аз он гувоҳӣ медиҳад, ки дар фазои конфигуратсияҳои чархии минтақаи C-терминали αS дар ҳузури поликатҳо мавқеъҳои афзалиятнок мавҷуданд.Ҳангоми баррасии фраксияи αS дар марҳилаи конденсатсионӣ дар шароити EPR таҷрибавӣ (84 ± 2%, 79 ± 7% ва 47 ± 4% барои αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ва αS/pLK мутаносибан — нигаред ба Илова. Расми 2e аз таҳлили додаҳо в), дидан мумкин аст, ки васеъшавии бо усули EPR муайяншуда асосан таъсири мутақобилаи минтақаи С-терминали αS бо поликатияҳои гуногун дар марҳилаи конденсатсионӣ (тағйироти асосӣ ҳангоми истифодаи TEMPOL-122-) инъикос меёбад. αS), на конденсати сафеда.Дар зонд афзоиши микровискозӣ мушоҳида мешавад.Тавре ки интизор мерафт, спектри EPR сафеда дар шароити ғайр аз LLPS ҳангоми илова кардани 1 M NaCl ба омехта комилан барқарор карда шуд (Расми иловагӣ 4b).Дар маҷмӯъ, маълумоти мо нишон медиҳанд, ки тағиротҳои аз ҷониби CW-EPR муайяншуда асосан таъсири мутақобилаи минтақаи C-терминали αS бо поликатсияҳои гуногун дар марҳилаи конденсатсионӣ инъикос меёбанд ва ин ҳамкорӣ бо pLK нисбат ба Тау қавитар ба назар мерасад.
Барои ба даст овардани маълумоти бештари сохторӣ дар бораи сафедаҳо дар коацерват, мо тасмим гирифтем, ки системаи LLPS-ро бо истифода аз NMR дар маҳлул омӯзем.Бо вуҷуди ин, мо метавонем танҳо фраксияи αS-ро, ки дар марҳилаи пароканда боқӣ мондаанд, муайян кунем, ки ин метавонад бо коҳиши динамикаи сафеда дар дохили коацерват ва фазаи зич дар поёни маҳлул дар таҳлили NMR бошад.Вақте ки мо сохтор ва динамикаи сафедаи боқимондаро дар марҳилаи парокандаи намунаи LLPS бо истифода аз NMR таҳлил кардем (Расми 5c, d), мо пай бурдем, ки сафеда дар ҳузури pLK ва ΔNt-Tau тақрибан якхела рафтор мекунад. ки дар сохти дуюмдарача ва динамикаи сутунмӯҳраи сафедаҳо буданд, ки дар натиҷаи таҷрибаҳо оид ба ивазшавии дуюмдараҷаи химиявӣ ва R1ρ релаксация ошкор карда шудаанд.Маълумоти NMR нишон медиҳад, ки C-терминуси αS ҳангоми нигоҳ доштани табиати бетартиби худ, ба монанди боқимондаи пайдарпаии сафедаҳо, аз сабаби таъсири мутақобила бо поликатҳо, чандирии конформацияро аз даст медиҳад.
Азбаски тавсеаи сигнали CW-EPR, ки дар марҳилаи конденсатшудаи TEMPOL-122-αS мушоҳида мешавад, таъсири мутақобилаи сафеда бо поликатсияҳоро инъикос мекунад, мо барои арзёбии наздикии ҳатмии αS ба поликатсияҳои гуногун дар сурати мавҷуд набудани LLPS (ҷамъ нашудани Buffer LLPS), ишора мекунад, ки таъсири мутақобила дар фазаҳои маҳлул ва мутамарказ якхелаанд (ки бо маълумоти мо тасдиқ карда шудааст, Расми 4а ва Расми 6).Ҳадаф аз он иборат буд, ки оё ҳама коацерватҳо, сарфи назар аз хосиятҳои умумии моеъи онҳо, дар сатҳи молекулавӣ ягон рафтори дифференсиалии асосиро нишон медиҳанд.Тавре ки интизор мерафт, спектри EPR бо афзоиши консентратсияи поликатсионалӣ васеъ шуд, ки коҳиши чандирии молекулавӣ аз ҳисоби таъсири мутақобилаи молекулавии ҳама шарикони мутақобила тақрибан то сер шуданро инъикос мекунад (расми 3e, Расми 6).pLK дар муқоиса бо ΔNt-Tau ва Tau441 дар таносуби камтари молярӣ (поликатсия: αS) ба ин сершавӣ ноил шуд.Дарвоқеъ, муқоисаи маълумот бо модели тақрибии ҳатмӣ бо дарназардошти n макони ҳатмии якхела ва мустақил нишон дод, ки доимии диссотсиатсияи намоёни pLK (~5 μM) як дараҷаи бузургтар аз Tau441 ё ΔNt-Tau (~50 μM) аст. ).µM).Гарчанде ки ин тахмини тахминӣ аст, ин аз он шаҳодат медиҳад, ки αS ба поликатсияҳои оддӣ бо минтақаҳои зарядҳои мусбати доимӣ наздикии баландтар дорад.Бо назардошти ин фарқияти наздикӣ байни αS ва поликатҳои гуногун, мо фарзия кардем, ки хосиятҳои моеъи онҳо метавонанд бо мурури замон ба таври гуногун тағир ёбанд ва аз ин рӯ, аз равандҳои гуногуни LSPT азоб кашанд.
Бо назардошти муҳити хеле серодам дар дохили коацервати сафеда ва табиати амилоиди сафеда, мо рафтори коацерватро бо мурури замон мушоҳида кардем, то равандҳои эҳтимолии LSPT-ро ошкор кунем.Бо истифода аз микроскопияи BF ва CF (Расми 4) мо мушоҳида кардем, ки αS/Tau441 ба андозаи зиёд дар маҳлул коасервататсия карда, қатраҳои калонеро ба вуҷуд меоранд, ки дар поёни чоҳ/слайд ҳамчун қатраҳои пурра тамос мегиранд ва тар мекунанд (расми иловагӣ). 7д);мо ин сохторхои аз поён ташаккулёфтаро «раххои сафедадор» меномем.Ин сохторҳо моеъ монданд, зеро онҳо қобилияти муттаҳидшавиро нигоҳ медоштанд (Расми иловагӣ 7b) ва онҳоро пас аз ба кор андохтани LLPS чанд соат дидан мумкин буд (Расми 4 ва Расми 7c).Мо мушоҳида кардем, ки раванди намнокӣ на дар рӯи маводи гидрофобӣ, балки гидрофиликӣ бартарӣ дорад (Расми 7а), тавре ки барои коацерватҳои электростатикӣ бо зарядҳои номутаносиб ва аз ин рӯ потенсиали баланди электростатикӣ пешбинӣ шудааст.Қобили зикр аст, ки якҷояшавии αS/ΔNt-Tau ва рафтинг ба таври назаррас коҳиш ёфт, дар ҳоле ки конденсатҳои αS/pLK ба таври назаррас коҳиш ёфтанд (расми 4).Дар муддати кӯтоҳи инкубатсия, қатраҳои αS/pLK тавонистанд, ки сатҳи гидрофилиро муттаҳид кунанд ва тар кунанд, аммо ин раванд зуд қатъ шуд ва пас аз 5 соати инкубатсия, танҳо ҳодисаҳои маҳдуди коалессенсия ва намшавӣ мушоҳида карда нашуд.– гузариш ба гел-катра.
Намояндаи BF (панелҳои хокистарӣ) ва CF (панелҳои рост, AF488 бо нишони αS бо сабз) намунаҳои коасервати дорои 100 μM αS (тамғаи 1% флуоресцентӣ) дар буфери LLPS дар ҳузури 100 μM Tau441 (боло) тасвирҳои флуоресцентсияи микроскопӣΔN -Tau (марказ) ё 1 mM pLK (поён) дар вақтҳои гуногуни инкубатсия ва баландиҳои фокусӣ (z, масофа аз қаъри табақи чоҳ).Тачрибахо новобаста аз хамдигар 4—6 маротиба такрор карда шуда, натичахои якхела ба даст оварда шуданд.Коасерватҳои αS/Tau441 пас аз 24 соат тар мешаванд ва рафҳои калонтар аз тасвирро ташкил медиҳанд.Сатри миқёс барои ҳама тасвирҳо 20 микрон аст.
Пас аз он мо пурсидем, ки оё ҳавзҳои сафедаи ба моеъ монанд, ки дар αS/Tau441 LLPS ташаккул ёфтаанд, ба ҷамъшавии амилоидҳои ҳама гуна сафедаҳои омӯхташуда оварда мерасонанд.Мо камолоти қатраҳои αS/Tau441-ро бо мурури замон бо микроскопияи WF дар ҳамон шароитҳое, ки дар боло зикр шудааст, пайгирӣ кардем, аммо бо истифода аз 1 μM AF488- αS ва Atto647N бо тамғаи Tau441 (расми 5а).Тавре ки интизор мерафт, мо дар тамоми раванди камолот ҷойгиршавии пурраи сафедаҳоро мушоҳида кардем.Ҷолиб он аст, ки аз тақрибан.Пас аз 5 соат дар дохили рафҳо сохторҳои боз ҳам пурзӯртаре мушоҳида шуданд, ки мо онҳоро «нуқтаҳо» меномидем, ки баъзеи онҳо бо αS колокализатсия шуда, баъзеи онҳо дар Tau441 бой шудаанд (расми 5а, тирҳои сафед).Ин доғҳо ҳамеша дар дохили салҳо барои αS/ΔNt-Tau нисбат ба αS/ΔNt-Tau бештар мушоҳида мешуданд.Дар қатраҳои системаҳои pLK ва Tau ягон доғҳои мушаххас вуҷуд надоштанд, ки барои синтез/тар кардан қобилият надоранд.Барои санҷидани он, ки оё ин доғҳои дорои αS ва Tau441 агрегатҳои ба амилоид монанданд, мо як таҷрибаи шабеҳро бо истифода аз микроскопияи CF анҷом додем, ки дар он Tau441 бо Atto647N нишонгузорӣ шуда буд ва 12,5 мкМ тиофлавин-Т (ThT) аз аввал илова карда шуд.ранг кардан.Гарчанде, ки рангкунии ThT-и қатраҳои αS/Tau441 ё рафҳо ҳатто пас аз 24 соати инкубатсия мушоҳида карда нашуд (расми 5б, сатри боло — қатраҳои боқимонда дар болои рафҳои сафеда), сохторҳои ThT-мусбат, ки дорои Atto647N-Tau441 дар дохили рафҳо буданд, хеле заиф буданд.ин андоза, шакл ва ҷойгиршавии доғҳои қаблан тавсифшударо такрор мекунад (расми 5б, қаторҳои мобайн ва поён) ва аз он шаҳодат медиҳад, ки доғҳо метавонанд ба агрегатҳои амилоидмонанд, ки дар коацерватҳои моеъи пиршуда пайдо мешаванд, мувофиқат кунанд.
WF 25 μM αS дар вақтҳои гуногуни инкубатсия ва баландиҳои фокусӣ (z, масофа аз қаъри бебанд) дар ҳузури 25 μM Tau441 (1 μM AF488 нишонгузорӣ αS ва Atto647N нишонгузорӣ Tau441) дар чоҳи пластинкаи микроскоп бо буффери LLPS) .Шаш таҷриба мустақилона бо натиҷаҳои шабеҳ такрор карда шуд.b Тасвири микроскопии CF аз 25 μM αS дар ҳузури 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-тамғаи Tau441) ва 12.5 μM тиофлавин-Т (ThT).Қатраҳои сафедаи вазншуда ва рахҳо ва доғҳои сафедаи гузошташуда мутаносибан дар сатрҳои боло ва миёна нишон дода шудаанд.Дар сатри поён тасвирҳои рафҳо ва қатраҳо аз 3 нусхаи мустақил нишон дода шудаанд.Тирҳои сафед нуқтаҳои ThT-мусбатро дар ҳарду панел нишон медиҳанд.Сатри миқёс барои ҳама тасвирҳо 20 микрон аст.
Барои муфассалтар омӯхтани тағирот дар шабакаи сафедаи коацерват ҳангоми гузариш аз моеъ ба сахт, мо тасвири флуоресцентии умри (FLIM) ва микроскопияи интиқоли энергияи резонанси Форстерро (FRET) истифода бурдем (Расми 6 ва Расмҳои иловагӣ 8 ва 9).Мо фарзия кардем, ки камолоти коасерватии қабат ба сохтори ҷамъшудаи сафедаи бештар конденсатшуда ё ҳатто ба сахт монанд боиси иртиботи зич байни протеин ва зондҳои флуоресценти ба он пайвастшуда мегардад ва эҳтимолан таъсири хомӯшкуниро ба вуҷуд меорад, ки дар мӯҳлати кӯтоҳшудаи зонд зоҳир мешавад (τ) , тавре ки қаблан гуфта шуда буд40.,41 ,42.Илова бар ин, барои намунаҳои дукарата тамғагузоришуда (AF488 ва Atto647N ҳамчун донор ва рангҳои аксептори FRET), ин коҳиши τ инчунин метавонад бо конденсатсияи коацерват ва афзоиши самаранокии FRET (E) ҳангоми LSPT ҳамроҳ шавад.Мо дар намунаҳои LLPS αS/Tau441 ва αS/ΔNt-Tau (25 мкМ ҳар як сафеда дар буфери LLPS дорои 1 мкМ AF488 бо нишони αS ва/ё Atto647N бо тамғаи Tau441 ё ΔNt-Tau) ташаккули рефҳо ва нуқтаҳоро бо мурури замон назорат кардем.Мо як тамоюли умумиро мушоҳида кардем, ки умри флуорессенси зондҳои AF488 (τ488) ва Atto647N (τ647N) ҳангоми ба камол расидани коацерватҳо каме коҳиш ёфт (расми 6 ва расми иловагӣ 8c).Ҷолиб он аст, ки ин тағирот барои нуқтаҳо дар дохили рафҳо ба таври назаррас афзоиш ёфт (расми 6c), ки нишон медиҳад, ки конденсатсияи минбаъдаи сафеда дар нуқтаҳо рух додааст.Барои тасдиқи ин, барои қатраҳои αS/ΔNt-Tau дар тӯли 24 соат дар тӯли умри флуоресцент ягон тағироти назаррас ба мушоҳида нарасид (Расми иловагӣ 8d), аз он шаҳодат медиҳад, ки гелатсияи қатраҳо равандест, ки аз доғ фарқ мекунад ва бо таҷдиди назарраси молекулавӣ ҳамроҳӣ намекунад. дар дохили коасерватҳо.Бояд қайд кард, ки нуқтаҳо дар αS, махсусан барои системаи αS/Tau441 андоза ва мундариҷаи тағйирёбанда доранд (Расми иловагӣ 8e).Пастшавии мӯҳлати флуорессенсияи спот бо афзоиши шиддат, алахусус барои Atto647N бо тамғаи Tau441 (Расми иловагӣ 8a) ва самаранокии баландтари FRET ҳам барои системаҳои αS/Tau441 ва ҳам αS/ΔNt-Tau ҳамроҳӣ мекард, ки ин нишон медиҳад, ки конденсатсияи минбаъдаи панҷ соат дар LLPS пас аз ангеза, сафедаҳо дар дохили нерӯи статикӣ конденсатсия мешаванд.Дар муқоиса бо αS/ΔNt-Tau, мо дар нуқтаҳои αS/Tau441 арзишҳои τ647N камтар ва то андозае баландтар τ488-ро мушоҳида кардем, ки бо арзишҳои пасттар ва якхелаи FRET ҳамроҳӣ мекунанд.Эҳтимол, ин метавонад ба он вобаста бошад, ки дар системаи αS / Tau441, фаровонии мушоҳидашуда ва интизоршудаи αS дар агрегатҳо нисбат ба Tau гетерогенӣ, аксар вақт субстоихиометрӣ аст, зеро худи Tau441 низ метавонад аз LLPS ва ҷамъшавӣ гузарад (Расми 8e). .Аммо, дараҷаи муттаҳидшавии қатраҳо, ташаккули раф ва муҳимтар аз ҳама, ҷамъшавии сафедаҳо дар дохили коацерватҳои моеъ ҳангоми мавҷудияти ҳам Tau441 ва ҳам αS ҳадди аксар аст.
Тасвирҳои микроскопияи флуоресцентии якумрӣ (FLIM) аз αS/Tau441 ва αS/ΔNt-Tau дар 25 мкм ҳар як сафеда (1 мкМ αS бо тамғаи AF488 ва 1 мкМ Atto647N бо тамғаи Tau441 ё ΔNt-PSLL) дар.Сутунҳо тасвирҳои намояндагии намунаҳои LLPS-ро дар вақтҳои гуногуни камолот (30 дақиқа, 5 соат ва 24 соат) нишон медиҳанд.Чаҳорчӯбаи сурх минтақаеро нишон медиҳад, ки доғҳои αS/Tau441 дорад.Давомнокии умр ҳамчун барҳои ранг нишон дода шудааст.Сатри миқёс = 20 микрон барои ҳама тасвирҳо.b Тасвири калонкардашудаи FLIM-и минтақаи интихобшуда, ки дар қуттии сурх дар панели a нишон дода шудааст.Диапазони ҳаёт бо истифода аз ҳамон миқёси рангҳо, ки дар панели a нишон дода шудаанд, нишон дода мешаванд.Сатри миқёс = 5 микрон.c Гистограммаҳо нишон медиҳанд, ки AF488 (ба αS замима карда шудааст) ё Atto647N (ба Tau замима карда шудааст) барои намудҳои гуногуни сафеда (қатраҳои-D-, raft-R- ва speckle-P), ки дар тасвирҳои FLIM сабт шудаанд, ки барои αS- сабт шудаанд, мӯҳлати тақсимоти Tau441 ва Намунаҳои коасерватии αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI барои D, 29-44 ROI барои R ва 21-51 ROI барои нуқтаҳои).Арзишҳои миёна ва миёна мутаносибан ҳамчун квадратҳои зард ва хатҳои сиёҳ дар дохили қуттиҳо нишон дода шудаанд.Ҳудуди поёнӣ ва болоии қуттӣ мутаносибан квартилҳои якум ва сеюмро ифода мекунанд ва арзишҳои ҳадди ақал ва максималӣ дар доираи диапазони 1,5-каратаи байникварталӣ (IQR) ҳамчун мӯй нишон дода шудаанд.Бартариятҳо ҳамчун алмосҳои сиёҳ нишон дода шудаанд.Аҳамияти оморӣ байни ҷуфтҳои тақсимот бо истифода аз санҷиши ду намунаи t, бо назардошти фарқиятҳои нобаробар муайян карда шуд.Арзишҳои дуҷонибаи t-санҷиш бо ситорачаҳо барои ҳар як ҷуфт маълумоти муқоисавӣ нишон дода шудаанд (* p-арзиш > 0,01, ** p-арзиш > 0,001, *** p-арзиш > 0,0001, **** p-арзиш > 0,00001), ns Ночизро нишон медиҳад (арзиши p> 0,05).Қиматҳои дақиқи p дар Ҷадвали иловагии 1 оварда шудаанд ва маълумоти аслӣ ҳамчун файлҳои хоми маълумот пешниҳод карда мешаванд.
Барои нишон додани минбаъдаи табиати ба амилоид шабоҳати доғҳо/агрегатҳо, мо намунаҳои коацервати доғнашударо дар тӯли 24 соат бо консентратсияи баланди (1 М) NaCl коркард кардем, ки дар натиҷа агрегатҳо аз коацерватҳои сафеда ҷудо шуданд.Вақте ки агрегатҳои ҷудошуда (яъне маҳлули парокандаи агрегатҳо) бо истифода аз микроскопияи қувваи атомӣ (AFM) мушоҳида карда шуданд, мо морфологияи асосан сферикиро бо баландии мунтазами тақрибан 15 нм мушоҳида кардем, ки дар шароити консентратсияи баланди намак, монанд ба рафтори фибрилҳои маъмулии амилоид аз сабаби таъсири пурқуввати гидрофобӣ дар рӯи замин (дар хотир доред, ки фибрилҳо одатан баландии ~ 10 нм доранд) (Расми иловагӣ 10а).Ҷолиб он аст, ки вақте агрегатҳои ҷудошуда бо ThT дар таҳлили стандартии флуорессенси ThT инкубатсия карда шуданд, мо афзоиши назарраси ҳосили квантии ThT-ро мушоҳида кардем, ки дар муқоиса бо он мушоҳида шуд, ки ранг бо фибрилҳои маъмулии амилоид αS инкубатсия карда шуд (расми 10b), ки ин нишон медиҳад, ки агрегатҳои коацерватӣ дорои сохторҳои ба амилоид монанд мебошанд..Дар асл, агрегатҳо ба консентратсияи баланди намак таҳаммулпазир буданд, аммо ба 4 М хлориди гуанидин (GdnHCl), ба монанди фибрилҳои маъмулии амилоид ҳассос буданд (Расми 10c).
Баъдан, мо таркиби агрегатҳоро бо истифода аз флуорессенсияи ягонаи молекулавӣ, коррелятсияи мушаххаси флуоресцентӣ/спектроскопияи байникоррелятсия (FCS/FCCS) ва таҳлили таркиши ошкоркунии тасодуфи ду ранг (TCCD) таҳлил кардем.Бо ин мақсад, мо агрегатҳоро ҷудо кардем, ки пас аз 24 соати инкубатсия дар намунаҳои 100 мкл LLPS дорои αS ва Tau441 (ҳарду 25 μM) дар якҷоягӣ бо αS бо 1 μM AF488 ва 1 μM Atto647N бо тамғаи Tau441 доранд.Маҳлули ҷамъшудаи парокандаи натиҷаро ба ҳолати мономолекулярӣ бо истифода аз ҳамон буфери бе PEG ва 1 M NaCl (ҳамон буфере, ки барои ҷудо кардани агрегатҳо аз коасерват истифода мешавад) ҳал кунед, то ҳама гуна таъсироти эҳтимолии электростатикӣ байни LLPS ва сафеда пешгирӣ карда шавад.Намунаи траекторияи вақти як молекуларо дар расми 7а дидан мумкин аст.Таҳлили FCCS/FCS (коррелятсияи байниҳамдигарӣ, CC ва автокоррелятсия, AC) нишон дод, ки агрегатҳои дорои αS ва tau дар намунаҳо зиёданд (ниг. каҷи CC дар расми 7b, панели чап) ва миқдори зиёди сафедаи мономерии боқимонда ҳамчун натиҷаи раванди ҳалкунанда (ниг. каҷҳои AC дар расми 7b, панели чап).Таҷрибаҳои назоратӣ дар як шароити маҳлул бо истифода аз намунаҳое, ки танҳо сафедаҳои мономерӣ доранд, ҳеҷ гуна каҷҳои CC-ро нишон надоданд ва каҷҳои AC бо модели диффузияи яккомпонентӣ (муодили 4), ки дар он сафедаҳои мономерӣ коэффитсиентҳои диффузияи пешбинишаванда доранд (расми 7б) хуб мувофиқат мекунанд. ), панели рост).Коэффисиенти диффузияи заррачаҳои ҷамъшуда камтар аз 1 мкм2/с ва сафедаҳои мономерӣ тақрибан 1 мкм2/с аст.50-100 мкм/с;арзишҳо ба арзишҳои қаблан нашршуда барои фибрилҳои амилоиди αS ва мономерии αS дар шароити шабеҳи ҳалли алоҳида шабоҳат доранд44.Вақте ки мо агрегатҳоро бо таҳлили таркиши TCCD таҳлил кардем (расми 7c, панели боло), мо дарёфтем, ки дар ҳар як агрегати ҷудошуда (гетероагрегати αS/Tau), тақрибан 60% агрегатҳои ошкоршуда ҳам αS ва ҳам tau доранд, тақрибан 30% танҳо tau, танҳо тақрибан 10% αS.Таҳлили стехиометрии гетероагрегатҳои αS/Tau нишон дод, ки аксари гетероагрегатҳо бо tau ғанӣ шудаанд (стехиометрия аз 0,5 камтар, шумораи миёнаи молекулаҳои tau дар як агрегат нисбат ба молекулаҳои αS 4 маротиба зиёд аст), ки ба кори мо дар FLIM дар situ мушоҳидашуда мувофиқ аст. тачрибахо..Таҳлили FRET нишон дод, ки ин агрегатҳо ҳарду сафеда доранд, гарчанде ки арзишҳои воқеии FRET дар ин ҳолат аҳамияти калон надоранд, зеро тақсимоти флюорофорҳо дар ҳар як агрегат аз сабаби зиёд будани протеини тамғанашуда дар таҷриба тасодуфӣ буд.Ҷолиб он аст, ки вақте ки мо як таҳлилро бо истифода аз варианти 45,46 баркамол амилоиди амилоидӣ анҷом додем (ниг. ба расми 11a, b), мо пай бурдем, ки гарчанде агрегатсияи электростатикии αS якхела буд (Расми 11c, d), қобилияти ташаккул додани агрегатҳо дар дохили коацерват ба таври назаррас коҳиш ёфт ва FLIM дар таҷрибаҳои situ якчанд нуқтаҳоро ошкор кард ва барои намунаҳои ҷудошудаи агрегатҳо хатҳои сусти коррелятсия мушоҳида карда шуданд.Бо вуҷуди ин, барои шумораи ками агрегатҳои ошкоршуда (танҳо даҳяки Tau441), мо мушоҳида кардем, ки ҳар як агрегат нисбат ба ин варианти Tau дар αS бой шудааст, тақрибан 50% агрегатҳои ошкоршуда танҳо молекулаҳои αS доранд ва αS аз ҳад зиёд гетерогенӣ буд. .агрегатҳо (ниг. ба расми иловагӣ. 11e), дар муқоиса бо агрегатҳои гетерогении аз ҷониби Tau441 тавлидшуда (расми 6f).Натиҷаҳои ин таҷрибаҳо нишон доданд, ки гарчанде ки худи αS қодир аст бо tau дар дохили коацерват ҷамъ шавад, дар ин шароит нуклеатсияи tau мусоидтар аст ва агрегатҳои амилоидмонанди ҳосилшуда метавонанд ҳамчун шакли αS ва tau амал кунанд.Бо вуҷуди ин, вақте ки ядрои аз tau бой ба вуҷуд меояд, таъсири мутақобилаи гетеротипии байни αS ва tau дар агрегатҳо бар таъсири мутақобилаи гомотипии байни молекулаҳои тау бартарӣ дорад;Мо инчунин шабакаҳои сафедаро дар коасерватҳои моеъи αS/tau мушоҳида мекунем.
Нишонҳои муваққатии флуоресцентии намояндагии молекулаҳои ягонаи агрегатҳои ҷудошуда, ки дар коацерватҳои электростатикии αS/Tau441 ташкил шудаанд.Таркишҳои мувофиқ ба коагрегатҳои αS/Tau441 (таркишҳо аз ҳадди нишондодашуда) дар се канали муайянкунӣ (AF488 ва эмиссияи Atto647N пас аз ҳаяҷони мустақим, хатҳои кабуд ва сурх, эмиссияи Atto647N пас аз ҳаяҷони ғайримустақим), FRET, хати бунафш) мушоҳида карда шуданд.b Таҳлили FCS/FCCS намунаи агрегатҳои ҷудошудаи αS/Tau441, ки аз LLPS гирифта шудаанд (панели чап).Каҷҳои автокоррелятсия (AC) барои AF488 ва Atto647N мутаносибан бо рангҳои кабуд ва сурх нишон дода шудаанд ва каҷҳои байникоррелятсия (CC) бо агрегатҳои дорои ҳарду рангҳо бо ранги арғувон нишон дода шудаанд.Каҷҳои AC мавҷудияти намудҳои сафедаи мономерӣ ва ҷамъшударо инъикос мекунанд, дар ҳоле ки каҷҳои CC танҳо паҳншавии агрегатҳои дукаратаро нишон медиҳанд.Ҳамон таҳлил, вале дар ҳамон шароити маҳлул, ки дар нуқтаҳои ҷудогона, намунаҳое, ки танҳо мономерии αS ва Tau441 доранд, ҳамчун назорат дар панели рост нишон дода мешаванд.в Таҳлили флуоресцентии флуоресцентии молекулаҳои ягонаи агрегатҳои ҷудошуда, ки дар коасерватҳои электростатикии αS/Tau441 ташкил шудаанд.Маълумот барои ҳар як агрегате, ки дар чор такрори гуногун пайдо шудааст (N = 152) дар муқобили стехиометрия, арзишҳои S ва самаранокии FRET (панели боло, сатри ранг рӯйдодҳоро инъикос мекунад) тарҳрезӣ шудааст.Се намуди агрегатҳоро ҷудо кардан мумкин аст: -αS-танҳо агрегатҳо бо S~1 ва FRET~0, агрегатҳои танҳо Tau бо S~0 ва FRET~1 ва агрегатҳои гетерогении Tau/αS бо миёнаравии S ва FRET Баҳодиҳии миқдор. Ҳарду сафедаҳои маркер, ки дар ҳар як агрегати гетерогенӣ (N = 100) ошкор карда шудаанд, дар панели поёнӣ нишон дода мешаванд (миқёси ранг ҳодисаро инъикос мекунад).Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумотҳои хом пешниҳод карда мешаванд.
Баровард ё пиршавии конденсатҳои сафедаи моеъ бо мурури замон ба сохторҳои ба гел монанд ё сахт алоқаманд аст, ки дар якчанд функсияҳои физиологии конденсат47 ва инчунин дар бемориҳо, ҳамчун як раванди ғайримуқаррарӣ пеш аз ҷамъшавии амилоидҳо 7, 48, 49 иштирок мекунанд. мо ҷудокунии марҳила ва рафторро муфассал меомӯзем.LSPT αS ҳангоми мавҷудияти поликатсияҳои тасодуфӣ дар муҳити назоратшаванда дар консентратсияи микромолярии паст ва шароити физиологии мувофиқ (дар хотир доред, ки консентратсияи ҳисобшудаи физиологии αS >1 μM50 аст), пас аз рафтори маъмулии термодинамикии LPS.Мо дарёфтем, ки αS, ки дорои минтақаи хеле манфии C-терминали дар рН физиологӣ мебошад, қодир аст дар маҳлули обӣ тавассути LLPS дар ҳузури пептидҳои бетартиби катионии баланд ба монанди pLK ё Tau тавассути ҷараёни электростатикӣ қатраҳои аз сафеда бойро ташкил кунад. конденсацияи мураккаб дар ҳузури макромолекулаҳои агрегатсия.Ин раванд метавонад дар муҳити ҳуҷайра таъсири мувофиқ дошта бошад, ки дар он αS бо молекулаҳои гуногуни поликатионӣ, ки бо агрегатсияи марбут ба беморӣ алоқаманданд, ҳам дар in vitro ва ҳам дар vivo51,52,53,54.
Дар бисёр тадқиқотҳо, динамикаи сафеда дар дохили қатраҳо ҳамчун яке аз омилҳои асосии муайянкунандаи раванди камолот баррасӣ шудааст55,56.Дар коасерватҳои электростатикии αS бо поликатионҳо раванди камолот аз афташ аз қувваи таъсири мутақобила бо поликатионҳо, валентнокӣ ва зиёд будани ин таъсирот вобаста аст.Назарияи мувозинат нишон медиҳад, ки манзараи мувозинати ду ҳолати моеъ мавҷудияти қатраи калоне хоҳад буд, ки аз биополимерҳо бой аст, ки LLPS-ро меронанд57,58.Афзоиши қатраҳоро тавассути камолоти Оствальд59, муттаҳидшавӣ60 ё истеъмоли мономери озод дар марҳилаи пароканда61 ба даст овардан мумкин аст.Барои αS ва Tau441, ΔNt-Tau ё pLK, қисми зиёди сафеда дар конденсат дар шароите, ки дар ин тадқиқот истифода шудааст, тамаркуз карда шудааст.Бо вуҷуди ин, дар ҳоле ки қатраҳои пурраи tau ҳангоми тар кардани сатҳ зуд ба ҳам мепайванданд, якҷояшавии қатраҳо ва тар кардан барои ΔNt-Tau ва pLK душвор буд, ки аз талафоти босуръати хосиятҳои моеъ дар ин ду система шаҳодат медиҳад.Тибқи таҳлили FLIM-FRET мо, қатраҳои кӯҳнаи pLK ва ΔNt-Tau дараҷаи шабеҳи ҷамъшавии сафедаҳоро (мӯҳлати шабеҳи флуорессенсия) ҳамчун қатраҳои аслӣ нишон доданд, ки шабакаи аслии сафеда нигоҳ дошта шудааст, ҳарчанд сахттар бошад.
Мо натиҷаҳои таҷрибавии худро дар модели зерин рационализатсия мекунем (расми 8).Қатраҳои муваққатан ташаккулёфта аксар вақт шабакаҳои сафеда мебошанд, ки ҷуброни электростатикӣ надоранд ва аз ин рӯ, минтақаҳои номутаносибии зарядҳо мавҷуданд, махсусан дар интерфейси қатраҳо, ки дар натиҷа қатраҳои дорои потенсиали баланди электростатикӣ ба вуҷуд меоянд.Барои ҷуброни заряд (падидае, ки маъмулан камшавии валентӣ номида мешавад) ва кам кардани потенсиали сатҳи қатраҳо, қатраҳо метавонанд полипептидҳои навро аз марҳилаи обшуда дар бар гиранд, шабакаҳои сафедаҳоро барои оптимизатсияи мутақобилаи заряд бо зарядҳо аз нав ташкил кунанд ва бо қатраҳои дигар ҳамкорӣ кунанд.бо сатҳҳо (тар кардан).Қатраҳои αS/pLK аз сабаби соддатар шабакаи сафедаашон (танҳо таъсири мутақобилаи гетеротипии байни αS ва pLK) ва наздикии бештар ба таъсири мутақобилаи сафедаҳо ва сафедаҳо, ба назар чунин менамояд, ки заряди конденсатро тезтар мувозинат кунад;дар ҳақиқат, мо кинетикаи зудтари протеинро дар коасерватҳои αS/pLK дар аввал ташкилшуда нисбат ба αS/Tau мушоҳида кардем.Пас аз кам шудани валентӣ таъсири мутақобила кам эфемерӣ мешавад ва қатраҳо хосиятҳои моеъи худро гум мекунанд ва ба қатраҳои гелмонанди оташнашаванда, ки потенсиали сатҳи пасти электростатикӣ доранд (ва аз ин рӯ сатҳро тар карда наметавонанд) табдил меёбанд.Баръакси ин, қатраҳои αS/Tau дар беҳсозии тавозуни заряди қатраҳо аз сабаби шабакаҳои мураккабтари сафедаҳо (ҳам бо ҳам мутақобилаи гомотипӣ ва гетеротипӣ) ва табиати заифтари мутақобилаи сафедаҳо камтар самаранок мебошанд.Ин ба қатраҳо оварда мерасонад, ки рафтори моеъро дар тӯли муддати тӯлонӣ нигоҳ медоранд ва потенсиали баланди электростатикиро нишон медиҳанд, ки майл ба роҳи муттаҳидшавӣ ва афзоиш (ба ин васила кам кардани майдони сатҳ / таносуби ҳаҷми қатраҳо) ва тар кардани химии сатҳи гидрофилӣ кам карда мешавад.Ин китобхонаҳои бузурги мутамаркази сафедаҳоро ба вуҷуд меорад, ки хосиятҳои моеъро нигоҳ медоранд, зеро мутақобила аз сабаби ҷустуҷӯи доимии оптимизатсияи заряд дар шабакаи сафедаҳо хеле муваққатӣ боқӣ мемонад.Ҷолиб он аст, ки шаклҳои N-терминалӣ буридашудаи Тау, аз ҷумла баъзе изоформҳои табиатан62, рафтори фосилавӣ нишон медиҳанд, ки баъзе коацерватҳо бо αS ба қатраҳои дарозмуддати гелӣ монанд мешаванд, дар ҳоле ки дигарон ба конденсатҳои калони моеъ табдил меёбанд.Ин дугонагӣ дар камолоти коацерватҳои электростатикии αS бо таҳқиқоти назариявӣ ва таҷрибавии LLPS мувофиқат мекунад, ки таносуби байни камшавии валентӣ ва ҷуброни электростатикиро дар конденсатҳо ҳамчун калиди назорати андозаи конденсат ва хосиятҳои моеъ муайян кардаанд.Механизм 58.61.
Ин схема роҳи тахминии ҷамъшавии амилоидҳоро барои αS ва Tau441 тавассути LLPS ва LSPT нишон медиҳад.Бо минтақаҳои иловагии аз анион бой (сурх) ва аз катион бой (кабуд), коасерватҳои αS ва tau электростатикӣ бо валенти қаноатбахш дорои энергияи сатҳи паст ва аз ин рӯ, камтар муттаҳид мешаванд, ки боиси пиршавии босуръати қатраҳо мешаванд.Ҳолати устувори гели агломератсияшуда ба даст оварда мешавад..Ин вазъият дар мавриди системаи αS/pLK аз сабаби наздикии баландтар ва шабакаи оддии мутақобилаи сафеда-ҷуфти он хеле мусоид аст, ки имкон медиҳад, ки гузариши зуд ба гел монандро фароҳам орад.Баръакс, қатраҳои дорои валенти ғайриқаноатбахш ва аз ин рӯ, минтақаҳои бо сафеда заряднок, ки барои мутақобила дастрасанд, барои кам кардани энергияи баланди сатҳи он коацерват омехта ва тар кардани сатҳи гидрофилиро осон мекунанд.Ин вазъият барои коасерватҳои αS/Tau441, ки шабакаи мураккаби бисёрваленти иборат аз таъсири мутақобилаи сусти Tau-Tau ва αS-Tau доранд, афзалтар аст.Дар навбати худ, коацерватҳои калонтар ба осонӣ хосиятҳои моеъи худро нигоҳ медоранд ва имкон медиҳанд, ки дигар мутақобилаи сафеда ба сафеда ба амал ояд.Дар ниҳоят, агрегатҳои гетерогении амилоид, ки дорои ҳам αS ва ҳам tau мебошанд, дар дохили моеъи коацерватӣ пайдо мешаванд, ки метавонанд ба онҳое, ки дар ҷисмҳои дохилшавӣ мавҷуданд, ки аломатҳои бемориҳои нейродегенеративӣ мебошанд, алоқаманд бошанд.
Сохторҳои калони ба моеъ монанд, ки ҳангоми камолоти αS/Tau441 бо муҳити хеле серғизо, вале динамикии сафеда ва ба андозаи камтар коасерватҳои αS/ΔNt-Tau ба вуҷуд омадаанд, барои ядрои ҷамъшавии сафедаҳо обанборҳои беҳтарин мебошанд.Мо воқеан ташаккули агрегатҳои сафедаи сахтро дар ин намуди коацерватҳои сафеда мушоҳида кардем, ки аксар вақт ҳам αS ва ҳам tau доранд.Мо нишон додем, ки ин гетероагрегатҳо бо таъсири мутақобилаи ғайриэлектростатикӣ мӯътадил мешаванд, қодиранд рангҳои амилоидҳои хоси ThT-ро ба мисли фибрилҳои маъмулии амилоид пайваст кунанд ва воқеан ба таъсироти гуногун муқовимати шабеҳ доранд.Агрегатҳои αS/tau, ки аз ҷониби LLPS ташкил карда шудаанд, дорои хосиятҳои ба амилоид монанд мебошанд.Воқеан, варианти баркамол Тау дар ҷамъшавии амилоидҳо дар ташаккули ин агрегатҳои гетерогении αS дар дохили коацервати электростатикии моеъ ба таври назаррас халалдор мешавад.Ташаккули агрегатҳои αS/Tau441 танҳо дар дохили коацерватҳо мушоҳида карда шуд, ки хосиятҳои моеъро нигоҳ медоштанд ва ҳеҷ гоҳ, агар коацерватҳо/қатраҳо ба ҳолати гел нарасиданд.Дар ҳолати охирин, афзоиши қувваи мутақобилаи электростатикӣ ва дар натиҷа, сахтии шабакаи сафедаҳо аз тағирёбии зарурии конформатсияи сафедаҳо барои муқаррар кардани мутақобилаи нави сафедаҳо, ки барои ядросозии амилоид заруранд, пешгирӣ мекунад.Бо вуҷуди ин, ин метавонад дар коацерватҳои чандиртаре, ба моеъ монанд ба даст оварда шавад, ки онҳо дар навбати худ эҳтимоли зиёд доранд, ки ҳаҷмашон афзоиш ёбад.
Далели он, ки ташаккули агрегатҳо дар фазаи конденсатшуда дар конденсатҳои калони αS/Tau афзалтар аст, назар ба қатраҳои хурд, ки зуд гел мешаванд, аҳамияти муайян кардани омилҳоеро, ки якҷояшавии қатраҳоро назорат мекунанд, таъкид мекунад.Ҳамин тариқ, на танҳо тамоюли ҷудошавии фаза вуҷуд дорад, балки андозаи конденсатро барои фаъолияти дуруст ва инчунин пешгирии бемориҳо назорат кардан лозим аст58,61.Натиҷаҳои мо инчунин аҳамияти тавозуни байни LLPS ва LSPT барои системаи αS/Tauро таъкид мекунанд.Дар ҳоле ки ташаккули қатраҳо метавонад аз ҷамъшавии амилоидҳо тавассути кам кардани миқдори мономерҳои сафеда дар шароити сершавӣ муҳофизат кунад, тавре ки дар системаҳои дигар пешниҳод шудааст63,64, синтези қатраҳо дар сатҳи баланди қатраҳо метавонад ба ҷамъшавии дохилии сафедаҳо тавассути азнавсозии сусти конформатсия оварда расонад.шабакаҳои сафеда..
Дар маҷмӯъ, маълумоти мо аҳамияти валенти муттаҳид ва мутақобилаи қаноатманд/қаноатбахшро дар шабакаҳои тарканда дар заминаи LSPT сахт таъкид мекунанд.Аз ҷумла, мо нишон медиҳем, ки конденсатҳои дарозмӯҳлати αS/Tau441 қодиранд ба таври муассир муттаҳид шаванд ва ядро ​​шаванд, то гетероагрегатҳои ба амилоид монандро ташкил кунанд, ки ҳарду сафедаҳоро дар бар мегиранд ва дар асоси натиҷаҳои таҷрибавии мо механизми молекулавӣ пешниҳод мекунанд.Якҷояшавии ду сафеда дар коасервати моеъи αS/Tau, ки мо дар ин ҷо гузориш медиҳем, метавонад воқеан бо ҳамҷойшавии ду сафеда дар инклюзияҳо алоқаманд бошад, ки аломатҳои беморӣ мебошанд ва метавонанд дар фаҳмидани муносибати байни LLPS ва ҷамъшавии амилоид, роҳро барои IDP пурборшаванда дар нейродегенератсия мекушояд.
Вариантҳои мономерии WT-αS, мутантҳои систеин (Q24C-αS, N122C-αS) ва вариантҳои ΔCt-αS (Δ101-140) дар E. coli ифода карда шуданд ва тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, тоза карда шуданд.5 мм DTT дар ҳама марҳилаҳои тозакунии мутантҳои αS систеин барои пешгирии ташаккули пайванди дисульфид дохил карда шуд.Изоформи Tau441 (плазмида аз Addgene #16316 гирифта шудааст), Варианти ΔNt-Tau (Δ1–150, бо роҳи клон кардани IVA бо праймерҳои CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ва Agg2153 бо варианти G2213 ба даст оварда шудааст. 5 праймер) фарҳангҳои E. coli буданд то OD600 = 0,6-0,7 дар 37 ° C ва 180 rpm афзоиш ёфт ва ифода бо IPTG барои 3 соат дар 37 ° C индуксия карда шуд.Ҳуҷайраҳоро дар 11,500 xg барои 15 дақиқа дар 4 °C ҷамъоварӣ кунед ва бо буфери шӯри дорои 150 mM NaCl бишӯед.Пеллетро дар буфери лизис боз кунед (20 мл дар як 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine μM10, μM0p).Қадами sonication дар ях бо амплитудаи 80% барои 10 импулс (1 дақиқа фаъол, 1 дақиқа хомӯш) анҷом дода шуд.Дар як УЗИ аз 60 мл зиёд набошад.Лизатҳои E. coli дар 95°С 20 дақиқа гарм карда, баъд дар ях хунук карда шуда, дар 127000×г дар давоми 40 дақиқа центрифуга карда мешаванд.Моддаи равшаншуда ба мембранаи 3,5 кДа (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Британияи Кабир) татбиқ карда шуд ва бар зидди 4 л буфери диализӣ (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2, DMM 2m) диализ карда шуд. , PMSF 0,1 мм) барои 10 соат.Сутуни мубодилаи катионҳои 5 мл (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ИМА) бо буфери мувозинат (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PMSF, 01) мувозинат карда шуд.Тау-лизат тавассути филтри PVDF 0,22 мкм филтр карда шуд ва ба сутун бо суръати ҷараёни 1 мл/дақ ворид карда шуд.Элюатсия тадриҷан гузаронида шуд, tau бо буфери 15-30% элюционӣ (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) элюта карда шуд.Фраксияҳо аз ҷониби SDS-PAGE таҳлил карда шуданд ва ҳар як фраксияҳои дорои як банд бо вазни интизории молекулавии tau бо истифода аз филтри центрифугаи 10 кДа консентратсия карда шуданд ва бо буфери дорои 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ва DTT 2 mM иваз карда шуданд. консентратсияи охирини сафеда 100 мкМ буд.Пас аз он маҳлули сафеда аз филтри PVDF 0,22 мкм гузаронида шуда, зуд ях карда шуд ва дар -80°C нигоҳ дошта шуд.Протеини K18 аз ҷониби профессор Алберто Боффи меҳрубонона таъмин карда шуд.Тозагии омодагӣ >95% буд, ки аз ҷониби SDS-PAGE ва MALDI-TOF/TOF тасдиқ шудааст.Цистеинҳои гуногун ба таври кимиёвӣ бо AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ИМА) ё TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада) нишонгузорӣ карда шуданд.бо абсорбенция ва MALDI-TOF/TOF тасдиқ карда шуданд.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ва K18 бо истифода аз Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Олмон) бо ҳамон тартиб бо пасмондаҳои систеини модарӣ дар мавқеъҳои 191 ва 322 нишонгузорӣ карда шуданд.Пардохти холис барои як харитаи боқимонда барои αS ва Tau441 бо истифода аз CIDER66 тавлид шудааст.
Поли-Л-лизини сахт (pLK DP 90-110 мувофиқи NMR аз таъминкунанда, Alamanda Polymers Inc, Хантсвилл, Алабама, ИМА) дар 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, рН аз 7,4 то 10 mM консентратсия гудохта шуд, раванд барои 5 соникатсионӣ дақиқа дар ваннаи оби ултрасадо ва нигоҳ доред дар -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ИМА) ва FITC-dextran-500 (Sigma -Oldrich, Sant Louis, MI, ИМА) об ҳалшавандаанд ва дар буфери LLPS васеъ паҳн мешаванд.Диализ намакҳои ифлоскунандаро хориҷ мекунад.Сипас онҳо тавассути филтри сӯзандору бо андозаи сӯрохиаш 0,22 мкм филтр карда шуданд ва консентратсияи онҳо бо истифода аз рефрактометр (Меттлер Толедо, Колумбус, Огайо, ИМА) ҳисоб карда шуд.Намунаҳои LLPS дар ҳарорати хонагӣ бо тартиби зерин омода карда шуданд: буфер ва экструзия омехта карда шуданд ва 1 мм трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etan-) 1, 2-диилдинитрил) кислотаи тетраастикӣ (EDTA, карбоксинт) ва омехтаи ингибитори протеазаи 1% (PMSF 100 мМ, бензимид 1 мМ, лейпептин 5 мкМ).Сипас αS ва поликатсияҳои омехта (параметрҳои pLK ё Tau) илова карда мешаванд.Барои таҷрибаҳои силсилаи вақтҳои тиофлавин-Т (ThT, Carbosynth, Compton, UK) консентратсияи умумии ThT-ро барои нисфи консентратсияи αS истифода баред.Намунаҳоро бодиққат, вале бодиққат омехта кунед, то якхела бошанд.Консентратсияи ҳар як ҷузъ аз таҷриба ба таҷриба, тавре ки дар қисмати Натиҷаҳо тавсиф шудааст, фарқ мекард.Азид дар консентратсияи 0,02% (w/v) истифода мешуд, вақте ки давомнокии таҷриба аз 4 соат зиёд буд.Барои ҳама таҳлилҳо бо истифода аз намунаҳои LLPS, иҷозат диҳед, ки омехта 5 дақиқа пеш аз таҳлил мувозинат шавад.Барои таҳлили паҳншавии рӯшноӣ, 150 мкл намунаҳо ба микропластинаҳои 96-чоҳи ҳатмӣ (µClear®, сиёҳ, F-Pottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) бор карда шуда, бо плёнкаи илтиёмӣ пӯшонида шуданд.ҶДММҳо тавассути чен кардани абсорбент дар 350 нм дар маркази маҳлул дар хонандаи плитаи CLARIOstar (BMG Labtech, Ортенберг, Олмон) назорат карда шуданд.Таҷрибаҳо дар се маротиба дар ҳарорати 25 ° C гузаронида шуданд ва хатогиҳо ҳамчун инҳирофи стандартӣ аз миёна ҳисоб карда шуданд.Марҳилаи маҳлул тавассути центрифугакунии намуна ва таҳлили гели SDS-PAGE миқдораш муайян карда шуд ва фраксияи αS дар фазаҳои иловашуда ва консентратӣ дар маҳлулҳои гуногуни LLPS миқдори муайян карда шуд.Намунаи 100 мкл LLPS, ки дорои 1 μM AF488-и αS-и тамғагузорӣ шудааст, бо омехтаи ҳамаҷониба ва баъд аз центрифуга дар 9600 × г барои 30 дақиқа омода карда шуд, ки пас аз он боришот одатан намоён буд.50 мкл болои супернатант барои муайян кардани миқдори сафеда бо истифода аз gel SDS-PAGE истифода шуд.Гельҳо бо филтрҳои AF488 бо истифода аз системаи тасвири gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ИМА) скан карда шуданд ё бо доғи Coomassie ранг карда шуда, бо филтрҳои мувофиқ визуалӣ карда шуданд.Бандҳои натиҷавӣ бо истифода аз версияи ImageJ 1.53i (Институтҳои Миллии Тандурустӣ, ИМА) таҳлил карда шуданд.Таҷрибаҳо дар ду таҷриба дар ду таҷриба бо натиҷаҳои шабеҳ гузаронида шуданд.
Одатан, 150 мкл намунаҳо ба микроплатаҳои 96-чоҳии ҳатмӣ татбиқ карда мешуданд ва дар ҳарорати хонагӣ дар микроскопи инверсивии Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Олмон) визуалӣ карда шуданд.Барои таҷрибаҳои нуқта, инчунин плитаҳои µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Олмон) ё микропластинаҳои полистиролии 96-чоҳ (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) истифода шуданд.Ҳамчун манбаи равшанӣ лампаҳои галоген ё галогени металлии симоб EL6000 истифода шуданд (барои тасвири BF/DIC ва WF мутаносибан).Барои микроскопияи WF, объекти ҳавоии 40x калонкунӣ (Leica Microsystems, Олмон) барои тамаркузи нур ба намуна ва ҷамъоварии он истифода шуд.Барои намунаҳои тамғаи AF488 ва ThT, барангезиш ва эмиссияи филтр бо маҷмӯаҳои филтрҳои стандартии GFP, филтрҳои барангезанда ва эмиссия мутаносибан 460–500 нм ва 512–542 нм филтрҳои гузариши маҷрои нм ва оинаи дихроикии 495 нм.Барои намунаҳое, ки бо Atto647N нишон дода шудаанд, маҷмӯи стандартии филтрҳои Cy5 бо филтрҳои ҳаяҷонбахш ва гузариши эмиссия мутаносибан 628–40 нм ва 692–40 нм ва оинаи дихроикии 660 нм истифода шуданд.Барои микроскопияи BF ва DIC, ҳамон объекти ҷамъоварии нури инъикосшударо истифода баред.Нури ҷамъшуда дар камераи CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Олмон) сабт шудааст.Вақти экспозиция барои тасвири микроскопии BF ва DIC 50 мс ва барои тасвири микроскопии WF 20-100 мс буд.Барои муқоиса, вақти экспозиция барои ҳама таҷрибаҳо бо ThT 100 мс буд.Таҷрибаҳои бо гузашти вақт барои визуализатсияи якҷояшавии қатраҳо гузаронида шуданд, ки тасвирҳо дар ҳар 100 мс барои якчанд дақиқа ҷамъоварӣ карда мешаванд.ImageJ (NIH, ИМА) барои таҳлили тасвир истифода шудааст.Таҷрибаҳо дар се нусха бо натиҷаҳои шабеҳ гузаронида шуданд.
Барои таҷрибаҳои colocalization, FRAP ва азнавсозии 3D, тасвирҳо дар микроскопи конфокалии инвертшудаи Zeiss LSM 880 бо истифода аз нашри кабуди ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Олмон) гирифта шуданд.Намунаҳои 50 мкл ба зарфҳои µ-Slide Angiogenesis Петри (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Олмон) татбиқ карда шуданд, ки бо полимери гидрофиликӣ (ibiTreat) коркард карда шуданд ва дар объекти 63 × обдиҳии нафт насб карда шуданд (Plan-Apochromat 63 × O/NA 1.4) дар DIC).Тасвирҳо бо истифода аз хатҳои лазерии аргон 458 нм, 488 нм ва 633 нм бо қарори 0,26 мкм/пиксел ва вақти экспозицияи 8 мкс/пиксел барои тирезаҳои ҳаяҷон ва ошкоркунии партобҳои 470–600 – 36 нм, ба даст оварда шуданд, ва 638-755 нм барои дидани ThT, AF488 ва Atto647N мутаносибан истифода шудааст.Барои таҷрибаҳои FRAP, аксбардории замонавии ҳар як намуна дар 1 кадр дар як сония сабт карда шуд.Таҷрибаҳо дар се нусха дар ҳарорати хонагӣ бо натиҷаҳои шабеҳ гузаронида шуданд.Ҳама тасвирҳо бо истифода аз нармафзори нашри кабуди Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Олмон) таҳлил карда шуданд.Каҷҳои FRAP ба эътидол оварда шуданд, тарҳрезӣ шуданд ва ба маълумоти шиддат/вақте, ки аз тасвирҳо бо истифода аз Zen 2 бо истифода аз OriginPro 9.1 гирифта шудаанд, мувофиқ карда шуданд.Хатҳои барқарорсозӣ ба модели моноэкспоненсиалӣ барои ҳисоб кардани диффузияи молекулавӣ бо истилоҳи экспоненсиалии иловагӣ барои ҳисоб кардани эффекти сафедкунии ба даст овардашуда насб карда шуданд.Пас аз он мо D-ро бо истифода аз радиуси номиналии сафедкунӣ ва ними умри қаблан муайяншудаи барқароршавӣ ҳамчун муодилаи Канг ва дигарон ҳисоб кардем.5 35 нишон дода шудааст.
Вариантҳои ягонаи систеини αS бо 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) дар мавқеъҳои 24 (TEMPOL-24-αS) ва 122 (TEMPOL-122-αS) синтез карда шуданд, мутаносибан.Нишондиҳии чарх Барои таҷрибаҳои EPR, консентратсияи αS дар 100 μM муқаррар карда шуд ва консентратсияи PEG 15% (w/v) буд.Барои шароитҳои гуногуни ҷамъкунӣ таносуби αS: pLK 1:10 буд, дар ҳоле ки таносуби αS: ΔNt-Tau ва αS: Tau441 дар 1: 1 нигоҳ дошта шуданд.Барои таҷрибаҳои ҳатмии титрсозӣ дар сурати набудани издиҳом, TEMPOL-122-αS дар 50 мкм нигоҳ дошта шуд ва поликатсияҳо дар консентратсияи афзоянда титр карда шуда, ҳар як ҳолати алоҳида омода карда шуданд.Андозагирии CW-EPR бо истифода аз спектрометри X-бандҳои Bruker ELEXSYS E580, ки бо резонатори Bruker ER4118 SPT-N1 муҷаҳҳаз шудааст, ки дар басомади печи печи (SHF) ~ 9,7 ГГц кор мекунад, гузаронида шуд.Ҳарорат дар 25 ° C муқаррар карда шуд ва аз ҷониби криостати нитрогени моеъ назорат карда мешавад.Спектрҳо дар шароити тоқатнашуда дар иқтидори МВт 4 мВт, амплитудаи модуляция 0,1 мТ ва басомади модуляцияи 100 кГц ба даст оварда шуданд.Шиддати спектр барои пешгирӣ кардани фарқияти консентратсияи спин байни намунаҳо ва коҳиши эҳтимолии спин аз сабаби консентратсияи боқимондаи агентҳои коҳишдиҳанда дар намунаҳои дорои Tau441 ё ΔNt-Tau (дар маҳлулҳои сафедаи аслӣ мавҷуд аст) ба эътидол оварда шуданд.Қиматҳои додашудаи g дар натиҷаи моделсозии спектралии EPR бо истифода аз нармафзори Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) дар Matlab®67 амалӣ карда шуданд.Барои моделсозии додаҳо моделҳои изотропии як/ду ҷузъӣ истифода шуданд.Пас аз ба эътидол овардани ҳама сигналҳо, боқимондаҳо бо роҳи тарҳ кардани ҳар як симулятсия аз спектри таҷрибавии мувофиқ ҳисоб карда шуданд.Барои таҳлили титратсияи ҳатмӣ, шиддатнокии нисбии банди сеюм ба банди дуюми спектри нормалшудаи EPR (IIII/III) барои назорат кардани пайвастагии поликатҳо ба αS истифода шудааст.Барои баҳодиҳии доимии диссоциатсия (Kd), каҷи натиҷавӣ ба модели тақрибии бо назардошти n макони пайвастшавии якхела ва мустақил насб карда шуд.
Таҷрибаҳои спектроскопии NMR бо истифода аз Bruker Neo 800 MHz (1H) спектрометри NMR, ки бо криопроб ва Z-градиент муҷаҳҳаз шудаанд, гузаронида шуданд.Ҳама таҷрибаҳо бо истифода аз 130-207 μM αS ва муодили αS/ΔNt-Tau ва pLK дар 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ва дар 15 ° C анҷом дода шуданд.Барои назорат кардани LPS тавассути NMR, ба намунаҳои қаблан омехташуда 10% PEG илова карда шуд.Дар графики вайроншавии сменаи химиявй (расми 1б) сменахои химиявии миёнаи 1Н ва 15Н нишон дода шудааст.Спектрҳои αS 2D1H-15N HSQC дар асоси супориши қаблӣ таъин карда шуданд (вориди BMRB # 25227) ва тавассути сабт ва таҳлили спектрҳои 3D HNCA, HNCO ва CBCAcoNH тасдиқ карда шуданд.Тағйирёбии кимиёвии 13Cα ва 13Cβ дар ҳузури ΔNt-Tau ё pLK барои чен кардани тағироти эҳтимолӣ дар тамоюлҳои сохтори дуюмдараҷа дар муқоиса бо тағирёбии кимиёвии αS дар конформатсияи холиси тасодуфии 68 ҳисоб карда шуданд (Расми иловагӣ 5c).Меъёрҳои R1ρ тавассути сабти таҷрибаҳои hsqctretf3gpsi (аз китобхонаи Брукер гирифта шудааст) бо таъхирҳои 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 ва 800 мс чен карда шуданд ва функсияҳои экспоненсиалӣ ба таъхири қулла дар шиддатнокии гуногун тасҳеҳ карда шуданд. маротиба барои муайян кардани R1ρ ва номуайянии таҷрибавии он.
Таҷрибаҳои микроскопияи флуорессенси ду ранги бо вақт ҳалшаванда дар микроскопи конфокалии MT200 (PicoQuant, Берлин, Олмон) бо дастгоҳи ҳисобкунии ягонаи фотон (TCSPC) бо вақт алоқаманд анҷом дода шуданд.Сарлавҳаи диодҳои лазерӣ барои барангезиши импулси байниҳамдигарӣ (PIE) истифода мешавад, чӯб аз мавҷи мавҷҳои ягона мегузарад ва ба қувваи лазерии аз 10 то 100 нВт барои 481 нм ва 637 нм хатҳои лазерӣ, ки пас аз оинаи дихроикӣ чен карда мешавад, танзим карда мешавад.Ин суръати оптималии ҳисобкунии фотонҳоро таъмин карда, аз таъсири алиасинги фотонҳо, сафедкунии фотонҳо ва сершавӣ пешгирӣ мекунад.Лаблабҳои ангиогенези μ-Слайд ё лавҳаҳо (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Олмон) мустақиман дар оби таъмидӣ дар болои линзаи Super Apochromat 60x NA 1.2 бо гиреҳи ислоҳкунанда (Olympus Life Sciences, Waltham, ИМА) ҷойгир карда шуданд.Оинаи 488/640 нм (Semrock, Lake Forest, IL, ИМА) ҳамчун тақсимкунандаи асосии нур истифода шуд.Радиатсияи фокуснашуда бо сӯрохи диаметраш 50 микрон маҳкам карда мешавад, пас радиатсияи фокусшуда тавассути тақсимкунандаи нури 50/50 ба 2 роҳи муайянкунанда тақсим карда мешавад.Дар назди детектор филтрҳои партовҳои банд (Semrock, Lake Forest, IL, ИМА) 520/35 барои ранги сабз (AF488) ва 690/70 барои ранги сурх (Atto647N) истифода шуданд.Ба сифати детекторҳо диодҳои якфотонии тарма (SPAD) (Micro Photon Devices, Болзано, Италия) истифода шуданд.Ҳам ҷамъоварӣ ва ҳам таҳлили маълумот бо истифода аз нармафзори дар тиҷорат дастраси SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Берлин, Олмон) анҷом дода шуданд.
Панҷоҳ микролитр намунаҳои LLPS ба чоҳҳои ангиогенези μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Олмон) татбиқ карда шуданд.Тасвирҳои натиҷавӣ ба 20 мкм болотар аз қаъри чоҳ барои масофаи оптималии кории объективӣ барои қатраҳои овезон ва то ~1 мкм барои рафҳо ва нуқтаҳо бо қарори меҳвари на камтар аз 0,25 мкм/пиксел ва вақти таъхири 400 мкм/пиксел равона карда мешаванд.Маълумотро бо истифода аз ҳадди шиддат дар асоси шиддати миёнаи пасзаминаи сигнал (PBG, миёна + 2σ) барои ҳар як канал интихоб кунед, то танҳо қатраҳои сафедаи моеъ, рахҳо ё доғҳо интихоб карда шаванд, ки ҳама пайдоиши эҳтимолиро аз марҳилаи пароканда филтр мекунанд.Барои таҳлили давомнокии умри ҳар як намуди (τ) ҳар як канал (сабз, “g” барои AF488 ва сурх, “r” барои Atto647N), мо минтақаҳои мавриди таваҷҷӯҳи (ROI) дорои қатраҳо, рафҳо ё доғҳоро интихоб кардем (Расми иловагӣ 1). ).8б) ва онҳоро бо роҳи мувофиқ кардани таназзули умри онҳо (τD, τR ва τP барои қатраҳо, рафҳо ё доғҳо, ба расми иловагӣ нигаред. 8c) дар ҳар як канал бо истифода аз таҳлили мувофиқати дум ва модели таназзули дукомпонентӣ ба даст овардаед.Миёнаи τ аз τ.ROI, ки барои мувофиқати бисёрэкспоненсиалӣ хеле кам фотонҳо тавлид кардаанд, аз таҳлил хориҷ карда шуданд.Буридаи истифодашуда <104 фотон барои рафҳо ва нуқтаҳо ва 103 барои қатраҳо буд.Қатраҳо ҳадди камтар доранд, зеро ба даст овардани каҷҳои пӯсида бо арзишҳои шиддатноктар душвор аст, зеро қатраҳо дар майдони тасвир одатан хурдтар ва камтаранд.ROI-ҳо бо шумораи фотонҳо аз ҳадди ҷамъшавии фотонҳо (ба > 500 ҳисоб/пиксел муқаррар карда шудаанд) низ барои таҳлил партофта шуданд.Каҷи каҷи таназзули шиддатро, ки аз минтақаи мавриди таваҷҷӯҳ ба даст омадааст, бо шиддат дар 90% аз ҳадди максималӣ (каме пас аз шиддатнокии максималии таназзул) аз оғози мӯҳлати хидмат мувофиқат кунед, то дахолати ҳадди ақали IRFро таъмин кунед ва дар баробари нигоҳ доштани яксон барои тамоми таназзули шиддат. Танзимот Равзанаи вақти нисбӣ 25 то 50 ROI барои рафҳо ва доғҳо ва 15-25 ROI барои қатраҳо таҳлил карда шуданд, тасвирҳо аз зиёда аз 4 такрор интихобшуда аз ҳадди ақал 3 таҷрибаи мустақил сабт шудаанд.Барои арзёбии фарқиятҳои оморӣ байни намудҳо ё байни системаҳои коацерватӣ санҷишҳои дуҷонибаи t истифода шудаанд.Барои таҳлили пиксел ба пиксели умри (τ), камшавии умумии умр дар майдони ҳар як канал ҳисоб карда шуд ва тақрибан модели сустшавии экспоненсиалии 2/3-компонентӣ гузаронида шуд.Пастшавии умри ҳар як пиксел бо истифода аз арзишҳои қаблан ҳисобшудаи τ насб карда шуд, ки дар натиҷа тасвири псевдорангҳои мувофиқи FLIM пайдо шуд.Диапазони умри дум дар тамоми тасвирҳои як канал якхела буд ва ҳар як таназзул фотонҳои кофӣ тавлид мекард, то мувофиқати боэътимодро таъмин кунад.Барои таҳлили FRET, пикселҳо бо истифода аз ҳадди шиддати пасттар аз 100 фотон интихоб карда шуданд, ки сигнали пасзаминаро (FBG) 11 фотонро ташкил медиҳад.Шиддати флуорессенсияи ҳар як канал бо омилҳои ислоҳии таҷрибавӣ муайяншуда ислоҳ карда шуд: 69 байниҳамдигарии спектралӣ α 0,004, барангезиши мустақим β 0,0305, самаранокии ошкоркунӣ γ 0,517 буд.Пас аз он, самаранокии FRET дар сатҳи пиксел бо истифода аз муодилаи зерин ҳисоб карда мешавад:
ки дар он FDD шиддатнокии флуорессент дар канали донорӣ (сабз) мушоҳида мешавад, FDA ин шиддатнокии флуорессент дар канали аксепторӣ (сурх) таҳти ҳаяҷони ғайримустақим мушоҳида мешавад ва FAA ин шиддатнокии флуорессент дар канали аксепторӣ (сурх) таҳти ҳаяҷони мустақим мушоҳида мешавад ( PIE).Дар канал) импульсҳои шиддатнокии флуоресцентҳо мушоҳида мешаванд.
100 мкл маҳлулҳои реаксияи LLPS, ки дорои 25 мкМ мономерии Tau441 (бо ё бидуни 25 мкМ αS) дар буфери LLPS (ба таври боло илова карда шудааст) дар микропластаҳои ҳатмнашавандаи 96-чоҳ бо рӯйпӯши фолгаи илтиёмӣ ва пайдоиши қатрачаҳо аз ҷониби микроскопи WF тафтиш карда шуд, ҷойгир кунед. мувозинат.дар давоми 10 дақиқа.Пас аз 48 соати инкубатсия дар ҳарорати хонагӣ, мавҷудияти рахҳои сафеда ва доғҳо тасдиқ карда шуд.Сипас моеъро аз болои рафҳо аз чоҳҳо бодиққат хориҷ кунед, сипас 50 л буфери диссоциатсия (10 мм HEPES, рН 7,4, 1 М NaCl, 1 мм DTT) илова кунед ва 10 дақиқа инкубатсия кунед.Консентратсияи баланди намак кафолат медиҳад, ки LLPS аз сабаби боқимондаи PEG такрор намешавад ва маҷмӯаҳои эҳтимолии сафеда, ки танҳо аз таъсири мутақобилаи электростатикӣ ташкил шудаанд, ҷудо карда мешаванд.Пас аз он қаъри чоҳ бо нӯги микропипетка бодиққат канда шуд ва маҳлули ҳосилшуда ба чоҳи холии мушоҳида гузаронида шуд.Пас аз инкубатсия кардани намунаҳо бо 50 мкМ ThT барои 1 соат, мавҷудияти нуқтаҳои ҷудошуда тавассути микроскопияи WF санҷида шуд.Фибрилҳои sonicated αS-ро тавассути инкубатсия кардани 300 мкл маҳлули 70-мкМ αS дар PBS бо pH 7.4, азиди натрий 0.01% дар 37 °C ва 200 rpm дар ларзиши орбиталӣ барои 7 рӯз омода кунед.Пас аз он маҳлул дар 9600 × г барои 30 дақиқа центрифуга карда шуд, пеллет дар PBS pH 7.4 дубора боздошта шуд ва садонок карда шуд (1 дақиқа, давра 50%, амплитудаи 80% дар sonicator Vibra-Cell VC130, Sonics, Нютон, ИМА) намунаҳои фибрил бо тақсимоти нисбатан якхелаи андозаи фибрилҳои хурд.
Таҳлили FCS/FCCS ва муайянкунии тасодуфи ду ранг (TCCD) дар ҳамон микроскопи конфокалии флуоресцентии MT200 бо вақт ҳалшаванда (Пико-Квант, Берлин, Олмон), ки барои таҷрибаҳои микроскопии FLIM-FRET бо истифода аз реҷаи PIE истифода шудааст, анҷом дода шуд.Қувваи лазерӣ барои ин таҷрибаҳо ба 6,0 мкВт (481 нм) ва 6,2 мкВт (637 нм) илова карда шуд.Омезиши ин қудратҳои лазерӣ барои тавлиди равшании шабеҳ барои ҷуфтҳои флюорофорҳои истифодашуда ҳангоми ноил шудан ба суръати оптималии ҳисоб ва канорагирӣ аз фотосафедкунӣ ва сершавӣ интихоб карда шуд.Ҳам ҷамъоварӣ ва ҳам таҳлили маълумот бо истифода аз нармафзори версияи 2.3, ки дар тиҷорат дастраси SymphoTime64 (PicoQuant, Берлин, Олмон) анҷом дода шуданд.
Намунаҳои агрегатҳои ҷудошудаи αS/Tau, ки бо истифода аз LLPS ба даст оварда шудаанд, дар буфери изолятсия то консентратсияи мувофиқи мономолекулярӣ (одатан 1:500 маҳлул, зеро агрегатҳо ҳангоми ҷудо кардани намунаҳои коацерват) аллакай дар консентратсияи паст қарор доранд.Намунаҳо бевосита ба пӯшишҳо (Корнинг, ИМА) бо маҳлули BSA дар консентратсияи 1 мг/мл пӯшонида шуданд.
Барои таҳлили PIE-smFRET дар каналҳои сабз ва сурх, ҳадди шиддати камтари 25 фотон барои филтр кардани сигналҳои шиддатнокии паст, ки аз рӯйдодҳои мономерӣ ба вуҷуд омадаанд, татбиқ карда шуд (дар хотир доред, ки мономерҳо аз намунаҳои ҷамъшуда нисбат ба агрегатҳои ҷудошуда зиёдтаранд).Ҳадди мазкур ҳамчун панҷ маротиба аз шиддати миёнаи αS мономерӣ, ки аз таҳлили намунаҳои мономери тоза гирифта шудааст, бо мақсади ба таври махсус интихоб кардани агрегатҳо барои таҳлил ҳисоб карда шуд.Схемаи гардонандаи PIE дар якҷоягӣ бо ба даст овардани маълумоти TSCPC, татбиқи филтри вазнкунии якумрӣ имкон дод, ки барои аз байн бурдани фосилаи замина ва спектр кӯмак мекунад.Шиддати алангаи бо истифода аз ҳадди боло интихобшуда бо истифода аз сигнали миёнаи пасзамина, ки аз гистограммаҳои пайдоиш нисбат ба шиддат/бини намунаҳои танҳо буферӣ муайян карда шудааст, ислоҳ карда шуд.Таркишҳое, ки бо агрегатҳои калон алоқаманданд, одатан дар пайи вақт (ба 1 мс муқаррар карда) якчанд қуттиҳои пайдарпайро ишғол мекунанд.Дар ин ҳолатҳо, як бинии қувваи максималӣ интихоб карда шуд.Барои таҳлили FRET ва стехиометрӣ омили аз ҷиҳати назариявӣ муайяншудаи гамма γ (0,517) истифода шудааст.Муқовимати спектралӣ ва саҳмҳои мустақими ҳаяҷонбахш дар қувваи лазерии истифодашаванда ночизанд (ба таври таҷрибавӣ муайян карда мешаванд).Самаранокӣ ва стехиометрии FRET дар таркиш ба таври зерин ҳисоб карда мешавад.