ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Қубури кафшери дуплексӣ барои ҷузъи кимиёвии саноати кимиё, Норасоии SPECC1L ба устувории буғумҳои пайвастшуда ва кам шудани рехтани ҳуҷайраҳои краниалии асаб оварда мерасонад.

Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 найчаи кафшери дуплекс барои саноати кимиё

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.як истеҳсолкунандаи пешқадам аст, ки ба қубурҳои бефосила аз пӯлоди зангногир, қубурҳои равшани тозашуда, қубурҳои ногусастанӣ ва ғайра тахассус дорад.Барои осон кардани мизоҷон мо қубурҳо ва қубурҳоро низ кафшер кардем.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.дорои таҷҳизоти пешрафтаи истеҳсолӣ ва озмоишӣ мебошад.Мо метавонем талаботи шуморо комилан қонеъ гардонем.Мувофиқи стандарт хеле қатъӣ, қубурҳои истеҳсолкардаи мо ҳамеша таҳаммулпазирии дурусти OD ва WT доранд.Назорати таҳаммулпазирӣ ба таври қатъӣ ба стандартҳои истеҳсолӣ мувофиқ аст.Маҳсулоти мо ҳамеша аз муштариён қаноатманд аст.Мизоҷон маҳсулоти моро хариданд, фоидаи бештар ба даст оварданд.
а) OD (диаметри берунӣ): 3,18 мм то 101,6 мм
б) ВТ (ғафсӣ девори): 0,5мм то 20мм
в) Дарозӣ: Мувофиқи талаботи муштарӣ
г) Стандартҳо: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ва ғайра
д) Усули раванд: ERW, EFW ва ғайра

Слайдерҳо се мақоларо дар як слайд нишон медиҳанд.Барои гузаштан дар слайдҳо тугмаҳои қафо ва ояндаро истифода баред ё тугмаҳои контролери слайдро дар охири ҳар як слайд ҳаракат кунед.
Ҳуҷайраҳои асаби краниалӣ (CNCC) пӯшишҳои асабии ҷанинро канда, ба камонҳои ҳалқӣ мегузаранд, ки аксари сохторҳои мобайниро ташкил медиҳанд.Норасоии CNCC дар этиологияи рахи рӯда, як нуқсони маъмулии модарзодӣ нақши муҳим дорад.Мутацияҳои гетерозиготии SPECC1L дар беморони гирифтори рахҳои атипӣ ва синдромӣ пайдо шудаанд.Дар ин ҷо, мо дар бораи ранг кардани мукаммали ҷузъҳои пайвасти каноникии илтиёмӣ (AJ), β-катенин ва Е-кадерин дар ҳуҷайраҳои кӯфташудаи SPECC1L гузориш медиҳем ва микрографҳои электронӣ паҳншавии апикалӣ-базалии AJ-ро нишон медиҳанд.Барои фаҳмидани нақши SPECC1L дар морфогенези краниофасиалӣ, мо модели муши норасогии Specc1l сохтем.Мутантҳои гомозиготӣ марговаранд ва баста шудани найҳои асаб ва ламинатсияи CNCC-ро нишон медиҳанд.Дар оғилҳои асабии мутант ранг кардани сафедаи AJ зиёд мешавад.Ин нуқсони AJ бо нуқсон дар деламинатсияи CNCC мувофиқ аст, ки парокандашавии AJ-ро талаб мекунад.Илова бар ин, мутантҳои Specc11 сигнализатсияи PI3K-AKT-ро коҳиш доданд ва апоптозро зиёд карданд.Дар in vitro, ҷилавгирии сабуки сигнализатсияи PI3K-AKT дар ҳуҷайраҳои навъи ваҳшӣ барои таҳрики тағйироти AJ кифоя буд.Муҳим он аст, ки тағироти AJ, ки дар натиҷаи шикастани SPECC1L ба вуҷуд омадаанд, метавонанд тавассути фаъолсозии роҳи PI3K-AKT баргардонида шаванд.Якҷоя гирифта, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки SPECC1L ҳамчун танзимгари нави сигнализатсияи PI3K-AKT ва биологияи AJ барои бастани найҳои асаб ва табақабандии CNCC зарур аст.
Ҳуҷайраҳои қафаси асаби краниалӣ (CNCCs) дар нейроэктодермаи дорсалӣ ҷойгир мешаванд ва аз нейроэпителийи пӯшишҳои асабҳои инкишофёбанда тавассути раванде, ки гузариши эпителиалӣ-мезенхималӣ (EMT) доранд, ҷудо мешаванд1,2,3.CNCC-ҳои эпителиалии қаблӣ пайвастагиҳои байниҳуҷайраҳоро вайрон мекунанд ва ба CNCC-ҳои мезенхималии муҳоҷиркунанда табдил меёбанд, ки камонҳои якум ва дуюми ҳалқро пур мекунанд ва қисми зиёди пайҳори краниофасиалиро ташкил медиҳанд.Ҳамин тариқ, генҳое, ки функсияи CNCC-ро танзим мекунанд, аксар вақт дар этиологияи аномалияҳои модарзодии краниофасиалӣ, аз қабили рахҳои орофасиалӣ вайрон мешаванд, ки аксар вақт танҳо дар ИМА ба 1/800 таваллуд таъсир мерасонанд.Яке аз нуқсонҳои модарзодӣ8.
Деламинатсияи CNCC бо бастани найи пешинаи асаб дар байни 8,5 ва 9,5 рӯзи рушди ҷанин дар мушҳо рост меояд.Мутантҳои як қатор генҳои рахи рӯдаи муш, инчунин як намуди нуқсони найҳои асабро нишон медиҳанд, аз ҷумла Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 ва Pdgfrα12.Бо вуҷуди ин, равандҳои бастани найҳои асаб ва стратификацияи CNCC-ро мустақил ҳисобидан мумкин аст, зеро муши мутантии Splotch (Pax3) бе ягон таъсир ба стратификация ё муҳоҷирати CNCC нуқсонҳоро дар бастани найҳои асаб нишон медиҳад 13,14.Моделҳои иловагии муш бо нуқсонҳо дар диссексияи CNCC ва бастани найҳои асаб барои муайян кардани заминаи умумии молекулавии ин ду раванд кӯмак мекунанд.
Ҷудокунии CNCC аз ҳуҷайраҳои нейроэпителиалӣ пароканда кардани пайвандҳои илтиёмӣ (AJs) -ро талаб мекунад, ки аз комплексҳои сафеда иборатанд, аз ҷумла E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin ва α-актинин, ки бо филаментҳои актин алоқаманданд 2. Тадқиқотҳои аз ҳад зиёди экспрессионалӣ E-cadherin дар қабатҳои асаб коҳиш ё таъхири деламинатсияи CNCC-ро нишон доданд.Баръакс, фурў нишондани E-cadherin боиси табақабандии барвақт мегардад15,16.Бисёре аз омилҳое, ки EMT ҳангоми стратификацияи CNCC миёнаравӣ мекунанд, омилҳои транскриптӣ (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ва сафедаҳои азнавсозии матритсаи берун аз ҳуҷайра (ECM) ба монанди металлопротеиназаҳои матритсавӣ (MMPs) мебошанд, аммо CNCCҳо ремосклетҳои мустақими AJ мебошанд. хануз маълум нест.Роҳи PI3K-AKT маълум аст, ки сатҳи E-cadherin, асосан аз тадқиқоти саратонро муқовимат мекунад17.Тадқиқотҳои охирин нишон доданд, ки аз даст додани сигнализатсия дар асоси PDGFα дар PI3K-AKT дар мушҳо ба нуқсонҳои краниофасиалӣ, аз ҷумла нуқсонҳои паҳлӯ ва найҳои асаб оварда мерасонад12.Аммо, муносибати байни роҳи PI3K-AKT ва устувории AJ ҳангоми стратификацияи CNCC норавшан аст.
Мо қаблан SPECC1L-ро ҳамчун аввалин гени мутант дар ду нафар бо рахи шадиде, ки аз даҳон то чашм паҳн мешавад, маълум кардем, ки бо номи рахи обликӣ (ObFC) ё Tessier IV18 маълум аст.Мутатсияҳои SPECC1L дар ду оилаи бисёрнаслӣ бо синдроми аутосомалии Opitz G/BBB (OMIM #145410), ки дар онҳо шахсони зарардида гипердистант ва шикастани лаб/тавай19 ва дар як оила бо синдроми дурии аз ҳад зиёди Тиби (OMIM #145420)20 муайян карда шудаанд. .зиёда аз нисфи ҳолатҳои синдроми Opitz G/BBB бо X алоқаманданд (OMIM #300000) ва дар натиҷаи мутатсияҳо дар гени MID1, ки сафедаи 22-и скелети ҳуҷайраи бо микротубул алоқамандро рамзгузорӣ мекунад, ба вуҷуд меоянд.Мо тахмин мезанем, ки SPECC1L, инчунин як сафедаи бо микротубулҳо ва ситоскелети актин алоқаманд аст, метавонад сигнализатсияро барои азнавсозии ситоскелети актин ҳангоми пайвастшавӣ ва муҳоҷирати ҳуҷайра миёнаравӣ кунад.Тавассути таҳқиқоти in vitro ва in vivo, мо ҳоло SPECC1L-ро ҳамчун танзимгари нави устувории AJ тавассути сигнализатсияи PI3K-AKT тавсиф мекунем.Дар сатҳи ҳуҷайра, норасоии SPECC1L боиси паст шудани сатҳи сафедаи пан-АКТ ва афзоиши дисперсияи апикалӣ-базалии AJ гардид, ки бо фаъолсозии кимиёвии роҳи AKT бартараф карда шуд.Дар vivo, ҷанинҳои нокифояи Specc11 баста шудани найҳои асаб ва коҳиши диссексияи CNCC-ро нишон медиҳанд.Ҳамин тариқ, SPECC1L дар сигнализатсияи ба таври хеле танзимшавандаи пайвастшавии ҳуҷайраҳо, ки барои функсияи муқаррарии CNCC ҳангоми морфогенези чеҳра заруранд, кор мекунад.
Барои тавсифи нақши SPECC1L дар сатҳи ҳуҷайра, мо хатти ҳуҷайраи устувори остеосаркомаи қаблан тавсифшуда U2OS-ро, ки дар SPECC1L18 камбуд дорад, истифода бурдем.Ин ҳуҷайраҳои устувори U2OS бо шикастани SPECC1L (kd) пастшавии мӯътадил (60-70%) дар сатҳи транскриптҳо ва сафедаҳои SPECC1L, дар баробари камбудиҳо дар муҳоҷират ва азнавташкилдиҳии ситоскелети актин 18. Баръакс, коҳиши шадиди муваққатии дар SPECC1L нишон дода шудааст, ки ба камбудиҳои митозӣ оварда мерасонад 23 .Пас аз тавсифи минбаъда, мо фаҳмидем, ки ҳуҷайраҳои устувори SPECC1L-kd мо морфологияро дар дараҷаи хеле баланди омезиш иваз карданд (Расми 1).Ҳуҷайраҳои назоратии инфиродӣ ва ҳуҷайраҳои kd дар омезиши паст ба ҳам монанд буданд (Расми 1A, D).24 соати пас аз синтез, ҳуҷайраҳои назоратӣ шакли кубии худро нигоҳ доштанд (расми 1B, E), дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd дароз шуданд (расми 1С, F).Андозаи ин тағирот дар шакли ҳуҷайра тавассути тасвири зиндаи ҳуҷайраҳои назоратӣ ва ҳуҷайраҳои kd (филми 1) сабт шудааст.Барои муайян кардани нақши SPECC1L дар ҳуҷайраҳои омехта, мо аввал ифодаи онро тафтиш кардем.Мо дарёфтем, ки сатҳи протеини SPECC1L ҳангоми синтез афзоиш ёфт (Расми 1G), дар ҳоле ки сатҳи транскрипти SPECC1L зиёд нашудааст (Расми 1H).Илова бар ин, бо зиёд шудани зичии ҳуҷайра, сафедаи SPECC1L дар сарҳадҳои байниҳуҷайра ҷамъ мешавад (расми 2A-E), ки намунаи он бо β-катенини бо мембрана алоқаманд аст (расми 2A'-E').Бо назардошти ассотсиатсияи SPECC1L бо ситоскелети актин 18,23 мо фарзия кардем, ки SPECC1L бо пайвандҳои илтиёмии актин (AJ) ҳамкорӣ мекунад.
(AF) Ҳуҷайраҳои SPECC1L нокаунт (DF) дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои назорати U2OS (AC) дар омезиши баланд (F) дароз мешаванд.Дар ин ҷо се аз шаш нуқтаи вақт (T1, T3, T6), ки мо барои зичии гуногуни ҳуҷайра интихоб кардаем, нишон дода шудаанд.(G) Таҳлили blot Western, ки нишон медиҳад, ки протеини SPECC1L дар дараҷаи баланди ҳамгироӣ дар муқоиса бо дараҷаи пасти пайвастагӣ дар ҳуҷайраҳои назорат мӯътадил аст.Блоки ғарбии SPECC1L банди интизории 120 кДа ва банди баландтари вазни молекулавиро нишон медиҳад, ки эҳтимолан пас аз тарҷума тағир дода шудааст (*).Таҳлили ғарбии blot дар як шароит барои омезиши паст ва баланд анҷом дода шуд.Тасвирҳо, ки SPECC1L-ро дар омезиши паст ва баланд нишон медиҳанд, аз ҳамон доғ гирифта шудаанд.Ҳамин доғ хориҷ карда шуд ва бо антитело β-актин дубора санҷида шуд.(H) Таҳлили миқдории RT-PCR дар сатҳҳои транскрипти SPECC1L тағироти назаррасро нишон надод.Сатри хатогиҳо SEM-ро аз чаҳор таҷрибаҳои мустақил намояндагӣ мекунанд.
(AE) Мо шаш нуқтаи вақтро (T1-T6) интихоб кардем, ки як қатор зичии ҳуҷайраҳоро намояндагӣ мекунанд, то таҳлили шакли ҳуҷайра ва тағирёбии AJ дар ҳуҷайраҳои U2OS бо шикастани SPECC1L (kd).Панҷгонаи аввали ин нуқтаи вақт ҳуҷайраҳои ягона (T1), 50-70% омезиши кластерҳои хурди ҳуҷайра (T2), синтез бидуни тағир додани ҳуҷайраҳои kd (T3), тағир додани ҳуҷайраҳои kd (T4) ва тағирёбии 24 соатро дар бар мегирифтанд.дар шакли паси ҳуҷайраҳои kd (T5).Протеини SPECC1L асосан дар ситоплазма дар T1 (A) пароканда карда шуд, аммо ҷамъшавии он дар сарҳадҳои байниҳуҷайраҳо дар лаҳзаҳои минбаъда мушоҳида шуд (B-E, тирҳо).(FJ) β-катенин ҷамъшавии шабеҳро дар сарҳадҳои байниҳуҷайравӣ, ки бо комплекси AJ алоқаманд аст, нишон медиҳад.(A'-E') SPECC1L ва β-катенин рангҳои такроршавандаро дар сарҳадҳои ҳуҷайра дар зичии баланди ҳуҷайра нишон медиҳанд (тирҳо).(F'-J') Дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd, ранг кардани β-катенин дар зичии пасти ҳуҷайра (F'-H') муқаррарӣ ба назар мерасад, аммо ҳангоми тағирёбии шакли ҳуҷайра васеъ мешавад (I', J'; тирҳо), ки нишон медиҳад, ки AJ тагьир ёфтаанд.Барҳо = 10 микрон.
Баъд мо кӯшиш кардем, ки таъсири норасоии SPECC1L-ро ба AJ муайян кунем.Мо якчанд маркерҳои бо AJ алоқамандро истифода кардем, аз ҷумла ҷузъҳои каноникии F-actin, myosin IIb, β-catenin ва E-cadherin24,25,26,27.Нахҳои фишори актин дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, зиёд шуданд (расми 3А, В) 18.Миозин IIb, ки бо филаментҳои актин алоқаманд аст, афзоиши шабеҳи ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd дар vitro нишон дод (расми 3C, D).β-катенин, ки бо AJ алоқаманд аст, дар мембранаи ҳуҷайра ба кадерин мепайвандад ва дар кубоцитҳои назоратӣ шакли муқаррарии ифодаи “мусал”-ро нишон медиҳад (расми 3E,G).Ҷолиб он аст, ки дар тасвирҳои ҳамвор бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ, ранг кардани β-катенин (расми 3E, F) ва E-кадхерин (расми 3G, H) дар мембранаи ҳуҷайраи ҳамҷояшудаи ҳуҷайраҳои норасоии SPECC1L намунаҳои намоёни рангкунии васеъро нишон доданд.Ин тавсеаи рангкунии β-катенини бо AJ алоқаманд дар ҳуҷайраҳои kd дар вақти омезиш бештар зоҳир мешуд, аммо пеш аз тағирёбии шакли ҳуҷайра ба назар мерасид (расми 2F-J, F'-J').Барои муайян кардани табиати физикии ин рангкунии васеъшудаи AJ, мо сарҳадҳои ҳуҷайраҳоро дар сатҳи апикалӣ-базалии ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd U2OS тавассути микроскопияи электронии интиқол (TEM) тафтиш кардем (Расми 3I, J).Дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои назоратӣ (расми 3I), ки минтақаҳои алоҳидаи зиччи электронии нишондиҳандаи AJ (тирҳо) доштанд, ҳуҷайраҳои kd (расми 3J) минтақаҳои калон ва ҳамсояи зичии баланди электронии AJ-ро дар баробари ҳавопаймои апикобазал нишон доданд..Илова бар ин, дар қисматҳои кундаланг, мо дар ҳуҷайраҳои kd қабатҳои васеъи мембранаи ҳуҷайраро мушоҳида кардем (расми S1A,B), ки намунаи васеъшудаи тасмаҳои рангкунии β-катенин ва Е-кадеринро шарҳ медиҳад (расми 3F, H).Барои дастгирии нақши SPECC1L дар AJs, β-катенин бо SPECC1L дар лизатҳои ҳуҷайраҳои омехтаи U2OS (расми 3K) як иммунопреципитатсия карда шуд.Дар баробари ранг кардани иммуностимуляторҳои AJ, таҳлили TEM бо фарзияи мо мувофиқ буд, ки норасоии SPECC1L зичии AJ-и апикалӣ ва дисперсияро зиёд мекунад.
(AH) Зиёд шудани рангкунии F-актин дар ҳуҷайраҳои kd дар давоми 48 соати пас аз синтез (T6; A, B).Рангшавии тағирёфтаи миозин IIb, ки бо F-актин алоқаманд аст (C, D).Намунаи ҳамвори ранг кардани мембранаи β-катенин ва E-кадхерин дар ҳуҷайраҳои назоратӣ (E, G) дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd (F, H) такмил дода шуд.Барҳо = 10 микрон.(I–J) Микрографҳои электронӣ, ки пайванди байни ҳуҷайраҳои апикалӣ-базалиро мушоҳида мекунанд.Ҳуҷайраҳои назоратӣ минтақаҳои алоҳидаи электрониро нишон медиҳанд, ки пайвандҳои часпакро нишон медиҳанд (I, тирҳо).Баръакс, тамоми пайванди апикалӣ-базалӣ дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd зичии электрон пайдо шуд (J, тирҳо), ки зичии зиёд ва парокандашавии пайвандҳои часпакро нишон медиҳад.(K) β-катенин бо SPECC1L дар лизатҳои ҳуҷайраи U2OS якҷоя карда шуд.Тасвир аз як нуқта гирифта шудааст, ки яке аз чаҳор таҷрибаҳои мустақилро ифода мекунад.
Барои фаҳмидани нақши SPECC1L дар морфогенези краниофасиалӣ, мо бо истифода аз ду хатти ҳуҷайраи мустақили доми ES, DTM096 ва RRH048 (BayGenomics, CA), ки интрон 1 ва транскриптҳои Specc1l-ро дар расми 11 гирифта шудаанд, як модели муши норасогии Specc1l эҷод кардем. .4А, расми S2).Ҷойгиршавии геномии варақаи вектори декоӣ тавассути пайдарпайии тамоми геном муайян карда шуд ва аз ҷониби PCR тасдиқ карда шуд (расми S2).Ҳарду тарҳи доми генҳо инчунин имкон доданд, ки дар дохили чаҳорчӯбаи гузоришгарони Specc11-lacZ ҳангоми дастгиршавӣ муттаҳид шаванд.Аз ин рӯ, ифодаи lacZ, ки бо рангкунии X-gal муайян карда шудааст, ҳамчун нишондиҳандаи ифодаи Specc11 истифода шудааст.Ҳарду аллел намунаҳои шабеҳи ифодаи lacZ-ро нишон доданд, ки доми гени DTM096 дар интрон 1 нисбат ба RRH048 дар интрон 15 ифодаи қавитарро нишон медиҳад (нишон дода нашудааст).Бо вуҷуди ин, Specc1l ба таври васеъ ифода карда мешавад, бо ифодаи махсусан қавӣ дар қабатҳои асаб дар E8.5 (Расми 4B), дар найҳои асаб ва равандҳои рӯй дар E9.5 ва E10.5 (Расми 4C, D) ва дар узвҳои инкишофёбанда. дар E10.5 ва чашмҳо (Тасвири 4D).Мо қаблан хабар дода будем, ки ифодаи SPECC1L дар камони аввали фарингалӣ дар E10.5 дар эпителий ва мезенхимаи зеризаминӣ18 мавҷуд аст, ки бо насли CNCC мувофиқ аст.Барои санҷидани ифодаи SPECC1L дар CNCC, мо пӯшишеҳои асабҳои E8.5 (Тасвири 4E-J) ва қисмҳои косахонаи сар E9.5-ро анҷом додем (Расми 4K-).Дар E8.5, SPECC1L оғилҳои асабро бошиддат ранг кард (расми 4E, H), аз ҷумла ҳуҷайраҳое, ки бо маркерҳои NCC ранг карда шудаанд (расми 4G, J).Дар E9.5, SPECC1L (расми 4K, N) сахт оғуштаи муҳоҷирати CNCC бо AP2A (расми 4L, M) ё SOX10 (расми 4O, P).
(A) Намоиши схематикии гени муш Specc11, ки воридкунии вектори фиребро дар клонҳои ҳуҷайраҳои ES DTM096 (intron 1) ва RRH048 (intron 15) нишон медиҳад.(BD) ранг кардани lacZ ҷанинҳои гетерозиготии Specc1lDTM096, ки ифодаи Specc1l-ро аз E8.5 то E10.5 намояндагӣ мекунанд.NE = нейроэктодерма, NF = оғили асаб, PA1 = камони аввали ҳалқум.(EP) SPECC1L иммуностимологӣ бо аломатҳои NCC AP2A ва SOX10 дар қабатҳои асабҳои E8.5 (NF; EJ) ва бахшҳои косахонаи сар E9.5 (KP).Рангшавии SPECC1L дар қабатҳои асабии E8.5 (E, H; сарлавҳаҳои тирҳо), аз ҷумла ҳуҷайраҳои бо AP2A (F, G; сарлавҳаҳои тирҳо) ва SOX10 (I, J; сарлавҳаҳои тирҳо) нишондодашуда ба таври васеъ мушоҳида карда шуд.Дар E9.5, SPECC1L CNCC-ҳои муҳоҷириро (K, N; тирҳо) бо AP2A (L, M; тирҳо) ва SOX10 (O, P; тирчаҳо) олуда кардааст.
Гузариш байни мушҳои гетерозиготаи Specc1lDTM096/+ ва Specc1lRRH048/+ нишон медиҳад, ки ду аллели доми генҳо якдилона нестанд ва гетерозиготаҳои мураккаб ва гомозиготаҳои ҷанин барои ҳарду аллели доми ген марговаранд (Ҷадвали S1).Коэффитсиентҳои Менделӣ паст шудани сатҳи зинда мондани гетерозиготаҳо ҳангоми таваллудро нишон доданд (пешбинишаванда 1,34 нисбат ба 2,0).Мо фавти перинаталӣ дар байни гетерозиготаҳоро қайд кардем, баъзеҳо аномалияҳои краниофасиалӣ доштанд (расми S3).Аммо, гузариши пасти ин фенотипҳои перинаталии краниофасиалӣ омӯзиши механизмҳои патофизиологии аслии онҳоро душвор мегардонад.Аз ин рӯ, мо ба фенотипи марговари ҷанини мутантҳои гомозиготаи Specc11 тамаркуз кардем.
Аксарияти ҷанинҳои мутантии гетерозигота ё гомозигота Specc1lDTM096/RRH048 пас аз E9.5–10.5 инкишоф наёфтанд (расмҳои 5A–D) ва найчаи асаб аз пеш пӯшида намешуд (расмҳои 5B, D) ва баъзан аз паси ҳам пӯшида (намоиш дода нашудааст) ..Ин нуқсони бастани найчаи асабҳои краниалӣ бо аксарияти CNCC бо DLX2 бо аломати DLX2 дар қабатҳои асаб дар E10.5 алоқаманд буд, ки ҳеҷ гуна диссексияро нишон намедиҳад (Тасвири 5A'-D').Барои муайян кардани он, ки андозаи умумии CNCC низ коҳиш ёфтааст, мо хатҳои CNCC-ро бо GFP дар хатҳои доми гении худ бо Wnt1-Cre ва ROSAMTmG қайд кардем.Мо GFP+ NCC ва GFP- (RFP+) ғайри NCC-ро аз тамоми ҷанин ҷараён медиҳем.Дар E9.5, таносуби CNCC-ҳои бо ҷараён мураттабшудаи GFP дар байни ҷанинҳои WT ва мутант (намоиш дода нашудааст) тағир наёфт, ки мушаххасоти муқаррарии CNCC-ро нишон медиҳад.Аз ин рӯ, мо фарзия кардем, ки рангҳои боқимондаи Wnt1-Cre ва DLX2 дар оғилҳои асабҳои фошшуда (Расми 5B') аз сабаби қабати ноқиси CNCC, эҳтимолан аз сабаби зиёд шудани зич ё парокандашавии ҳуҷайраҳои AJ, тавре ки дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd дида мешавад, буд.Мо маркерҳои NCC SOX10, AP2A ва DLX2-ро барои тасдиқи мавҷудияти CNCC дар оғили асаб истифода кардем (Расми 5E-R).Дар E8.5, рангкунии қабати асаб барои ҳар се нишонгари NCC дар қисматҳои WT (расми 5E, G, I) ва мутант Specc1l (расми 5F, H, J) мушоҳида карда шуд.Дар E9.5, дар ҳоле ки маркерҳои NCC муҳоҷири NCC дар қисматҳои WT (расми 5M, O, Q), рангкунии боқимондаи NCC дар пӯшишеҳои асабии ҷанинҳои мутант Specc1l мушоҳида карда шуд (расми 5N, P, R).Азбаски SOX10 ва DLX2 муҳоҷири CNCC-ро нишон медиҳанд, ин натиҷа аз он шаҳодат медиҳад, ки CNCC-ҳои норасогии SPECC1L ба мушаххасоти пас аз муҳоҷират ноил мешаванд, аммо аз қабатҳои асабӣ муҳоҷират карда наметавонанд.
Норасоии Specc11 боиси баста шудани ноқиси найчаи асаб, деламинатсияи ҳуҷайраҳои крани асаб ва AJ мегардад.
(A, B') E9.5 WT (A) Ҷанин, ки ҳуҷайраҳои муҳоҷиркунандаи асаби косахонаи сар (CNCC) бо нишони Wnt1-Cre (A').Баръакс, ҷанинҳои мутант Specc11 оғилҳои кушодаи асаб (B), сари тирҳо) ва CNCC-ҳоро, ки муҳоҷират накардаанд (B', тирчаҳо) нишон медиҳанд.(C, D') Тасвирҳои саҳроии равшан (C, D') ва иммуностимуляторӣ (C', D') аломати CNCC DLX2 аз ҷанинҳои E10.5 WT (C, C') ва Specc1l (D, D').Дар ҷанинҳои WT E10.5, DLX2-мусбати CNCC камонҳои гилро мустамлика мекунанд (C', тирҳо), дар мутантҳо, рангҳои намоён дар қабатҳои кушоди асаб (D', тирҳо) ва дар камонҳои аввалини ҳалқум (D',) боқӣ мемонанд. тирҳо).) бо баъзе рангҳо (тирҳо), ки деламинатсия ва муҳоҷирати CNCC-ро нишон медиҳанд.ER) Қисмҳои ҷанинҳои мутантии WT ва Specc1l дар марҳилаҳои E8.5 (E–L) ва E9.5 (M–R) бо аломатҳои NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) ва DLX2 (I, J, Q, R).Дар E8.5, рангкунии NCC дар қабати асабҳои навъи ваҳшӣ (NF) ва бахшҳои мутант мушоҳида карда шуд.Якҷоя ранг кардани SOX10 ва β-катенин дар E8.5 WT (K) ва мутант (L) афзоиши рангшавии β-катенинро дар сарҳадҳои ҳуҷайра дар оғилҳои асаб ошкор карданд.Дар E9.5, рангкунии намуди ваҳшӣ аз CNCC-ҳои муҳоҷир (M, O, Q) мушоҳида карда шуд, дар ҳоле ки дар мутантҳо, CNCC-ҳои стратификациянашуда пӯшишҳои асабҳои кушодро (N, P, R) доғ карданд.(S–Z) Таҳлили тамғагузории AJ in vivo дар қисмҳои тоҷии WT ва Specc11DTM096/RRH048 ҷанин бо мутатсияи E9.5.Дар кунҷи рости болоии ҳавопаймои тахминии секция нишон дода шудааст.Дар қисматҳои бофтаҳои мутант зиёд ранг кардани F-актин (S, T) ва миозин IIb (U, V) мушоҳида шудааст.Монанди натиҷаҳои in vitro дар расми 3, дар ҷанинҳои мутант, рангкунии мукаммали мембрана барои β-катенин (W, X) ва E-cadherin (Y, Z) мушоҳида карда шуд.(AA-BB) Микрографи электронии қисмати ҷанини навъи ваҳшӣ, ки берун аз сарҳади ҳуҷайраи апикалӣ-базалӣ назар мекунад, як минтақаи зиччи электрониро нишон медиҳад, ки нишонаи пайвандҳои илтиёмиро нишон медиҳад (АА, тирҳо).Баръакс, дар қисматҳои ҷанинҳои мутант Specc11 (BB, тирҳо), тамоми пайванди апикобазал зичии электрон аст, ки зичии зиёд ва парокандашавии пайвандҳои часпакро нишон медиҳад.
Барои санҷидани фарзияи мо, ки камшавии қабати аз сабаби тағирёфтаи AJ аст, мо тамғагузории AJ-ро дар қабатҳои асабии ҷанинҳои мутант Specc1l тафтиш кардем (расми 5S-Z).Мо афзоиши нахҳои фишори актинро мушоҳида кардем (расми 5S, T) ва ҳамзамон афзояндаи локализатсияи рангкунии миозин IIB дар нахҳои актин (расми 5U, V).Муҳим он аст, ки мо афзоиши рангшавии β-катенин (расми 5W, X) ва E-cadherin (расми 5Y, Z) дар сарҳадҳои байниҳуҷайраҳоро мушоҳида кардем.Мо инчунин ранг кардани β-катенини NCC-ро дар қабатҳои асабии ҷанинҳои E8.5 тафтиш кардем (расми 5K, L).Ранги β-катенин дар оғилҳои асабии мутант Specc1l қавитар ба назар мерасид (Расми 5L ва K), ки аз он шаҳодат медиҳад, ки тағироти AJ оғоз шудааст.Дар микрографҳои электронии қисмҳои косахонаи сар аз ҷанинҳои E9.5, мо боз зиёдшавии рангҳои паҳншудаи электронии зиччиро дар ҷанинҳои мутант Specc1l нисбат ба WT мушоҳида кардем (расми 5AA, BB ва S1E-H).Якҷоя гирифта, ин натиҷаҳо натиҷаҳои in vitro-и моро дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd U2OS дастгирӣ мекунанд ва нишон медиҳанд, ки рангкунии ғайримуқаррарии AJ пеш аз табақабандии CNCC дар ҷанинҳои мутантии мост.
Бо назардошти муносибати маълуми антагонистии байни фаъолияти AKT ва устувории E-cadherin, 17,28 мо ҷалби сигнализатсияи PI3K-AKT-ро фарзия кардем.Илова бар ин, мо дар баъзе ҷанинҳои мутантии мо блистерҳои субэпидермалиро мушоҳида кардем, ки аз марговар (<5%) дар E9.5-10.5 раҳо ёфтанд ва ба ҷои он дар атрофи E13.5 ҷойгир шуданд (расми S3).Весикулаҳои субэпидермалӣ аломати коҳиши сигнали PI3K-AKT дар асоси PDGFRα12 мебошанд.Fantauzzo ва дигарон.(2014) гузориш дод, ки вайроншавии фаъолсозии PI3K дар асоси PDGFRα дар ҷанинҳои мутантии PdgfraPI3K/PI3K боиси весикулаҳои субэпидермалӣ, нуқсонҳои найҳои асаб ва фенотипҳои рахнаи рахна мегардад.Дар ҳақиқат, сатҳҳои пан-АКТ ва фаъоли фосфоризатсияшудаи Ser473-AKT дар бофтаҳои мутант Specc1l дар vivo то боздошти ҷанинии E9.5 коҳиш ёфтанд (расми 6A-D).Паст шудани сатњи фосфоризатсияшудаи Ser473-AKT метавонад комилан аз сабаби кам шудани сатњи пан-AKT дар vivo (расми 6E) ва in vitro (расми 6F) бошад.Пастшавии in vitro танҳо вақте мушоҳида карда шуд, ки ҳуҷайраҳои U2OS бо тағирот дар шакли ҳуҷайра ва зичии AJ ба таври сахт пайваст буданд (Расми 6D).Ҳамин тариқ, маълумоти мо нишон медиҳанд, ки SPECC1L як танзимгари нави мусбии сигнализатсияи PI3K-AKT дар морфогенези краниофасиалӣ мебошад.
(A–E) E8.5 (A,B) ва E9.5 (C,D) қисмҳои косахонаи сар ё лизатҳои E9.5 аз ҷанинҳои мутант Specc1l (E), ки сатҳҳои фаъоли фосфоризатсияшудаи S473-AKT ва камшавии сафедаи пан-АКТ-ро нишон медиҳанд , нисбат ба WT назорати.Блотинги ғарбӣ дар лизатҳои навъи ваҳшӣ ва лизатҳои мутантӣ дар як шароит анҷом дода шуд.Тасвирҳое, ки барои SPECC1L нишон дода шудаанд, аз як блок гирифта шудаанд.Ҳамин доғ хориҷ карда шуд ва бо антителоҳои анти-пан-ACT ва β-актин дубора тафтиш карда шуд.Сатҳи Pan-AKT дар қабатҳои асабии E8.5 (A, B) ва сатҳҳои фосфоризатсияшудаи S473-AKT дар қисмҳои косахонаи сар E9.5 ба таври назаррас коҳиш ёфтанд.(F) Сатҳи Pan-AKT дар лизатҳои ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd U2OS, ки дар омезиши баланд ҷамъоварӣ шудаанд, ба ин монанд коҳиш ёфтанд.Сатри хатогиҳо SEM-ро аз се миқдори мустақили blot Western намояндагӣ мекунанд.(GJ) Қисмҳои ҷанинҳои WT дар E9.5 бо KI67 ранг карда шудаанд ва мутаносибан каспазаи 3 ҷудо карда шудаанд, ки паҳншавии ҳуҷайраҳо (G, G') ва фаъолияти ками апоптозиро (H, H') нишон медиҳанд.Ҷанинҳои мутант Specc11 паҳншавии ҳуҷайраҳои муқоисашавандаро нишон медиҳанд (I), аммо шумораи ҳуҷайраҳои аз апоптоз гузаштан ба таври назаррас зиёд мешавад (J).
Пас аз он мо маркерҳои пролифератсия ва апоптозро тафтиш кардем.Мо дар паҳншавии ҷанинҳои E9.5 (расми 6E, G дар муқоиса бо I) ягон фарқиятро мушоҳида накардем, ки индекси паҳншавии 82,5% барои мутантҳои WT ва 86,5% барои мутантҳои Specc1l, ки бо рангкунии KI67 чен карда шудааст (p <0,56, Фишер) санҷиши дақиқ).Ба ҳамин монанд, мо ҳеҷ гуна фарқияти апоптозеро, ки тавассути ранг кардани каспазаи 3 дар қабатҳои асаб дар E8.5 то боздошти ҷанин (нишон дода нашудааст) чен карда шудааст, мушоҳида накардем.Баръакс, апоптоз дар ҳама ҷанинҳои мутантии E9.5 ба таври назаррас афзоиш ёфт (расми 6F, H ва J).Ин афзоиши умумии апоптоз бо коҳиши сигнали PI3K-AKT ва марги барвақти ҷанин мувофиқат мекунад29,30,31.
Минбаъд, барои тасдиқи нақши сабабӣ барои сигнализатсияи PI3K-AKT дар тағирёбии AJ дар ҳуҷайраҳои kd, мо роҳи химиявиро дар ҳуҷайраҳои назорат ва kd тағир додем (Расми 7A-F).Мо ҳамчун маркер фенотипи тағирёбии шакли ҳуҷайраро, ки дар ҳуҷайраҳои омехтаи SPECC1L-kd мушоҳида мешавад, истифода бурдем, ки мо бо истифода аз таносуби андозаи дарозтарин (дарозӣ) ба андозаи мувофиқи амудӣ (паҳно) миқдори муайян кардем.Барои ҳуҷайраҳои нисбатан мудаввар ё кубӣ таносуби 1 дар назар аст (Расми 7G).Илова ба шакли ҳуҷайра, мо инчунин таъсирро ба AJ тавассути ранг кардани β-катенин тасдиқ кардем (расми 7A'-F').Пешгирии роҳи PI3K-AKT бо истифода аз wortmannin барои тағир додани шакли ҳуҷайра дар ҳуҷайраҳои назоратӣ (Расми 7A,C) ва AJ (расми 7A') кифоя буд.Фаъолкунандаи PI3K-AKT SC-79 ба шакли ҳуҷайра (расми 7А, E) ё васеъшавии AJ (расми 7А') дар ҳуҷайраҳои назоратӣ таъсир нарасонд.Дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd, фишори минбаъдаи роҳи PI3K-AKT боиси афзоиши апоптоз (расми 7B,D) ва афзоиши назарраси рангкунии β-катенин (расми 7B') гардид, ки бо мутантҳои вазнини мо дар vivo мувофиқ аст.Муҳим он аст, ки фаъолсозии роҳи PI3K-AKT шакли ҳуҷайраро ба таври назаррас беҳтар кард (Расми 7B, F) ва фенотипҳои AJ (Расми 7B").Тағйирот дар шакли ҳуҷайра ҳамчун таносуби даврии ҳуҷайра (CCR) миқдорӣ карда шуданд ва барои аҳамияти дар боло тавсифшуда муқоиса карда шуданд (расми 7G).Дар ҳақиқат, дар ҳуҷайраҳои назоратӣ (расми 7G, CCR = 1.56), табобати вортманнин барои ба таври назаррас тағир додани шакли ҳуҷайра кофӣ буд (расми 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) ба андозае, ки ба мушоҳидашуда монанд аст. дар SPECC1L.-кд ҳуҷайраҳои (расми 7G, CCR = 3.46).Табобати Вортманнин бо ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd (расми 7G, CCR = 3.60, ночиз) аз ҳуҷайраҳои kd коркарднашуда муҳимтар набуд (расми 7G, CCR = 3.46, ночиз) ё ҳуҷайраҳои назоратии вортманнин (расми 7G)., CCR = 3,46, ночиз) ба таври илова ба дарозшавии ҳуҷайра таъсир мерасонад (7G, CCR = 3,61, ночиз).Муҳимтар аз ҳама, фаъолкунандаи SC-79 AKT фенотипи дарозшудаи ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd -ро барқарор кард (расми 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ин натиҷаҳо тасдиқ мекунанд, ки SPECC1L сигнализатсияи PI3K-AKT-ро танзим мекунад ва нишон медиҳад, ки коҳиши мӯътадили SPECC1L ба пайвастшавии ҳуҷайра таъсир мерасонад, дар ҳоле ки коҳиши қавӣ ба апоптоз оварда мерасонад (расми 8).
(A–F') Ҳуҷайраҳои назорат (A, C, E) ва SPECC1L-kd (B, D, F), ки бо ингибитори роҳи PI3K-AKT вортманнин (C, D) ё фаъолкунандаи SC-79 (E, F) табобат карда шудаанд. .Ҳуҷайраҳои назоратии коркарднашуда мукааб мебошанд (A) бо рангҳои муқаррарии ҳуҷайраҳои β-гурба (A'), дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои kd дароз (B) бо рангкунии β-гурбаҳои зиёд (B') мебошанд.Пас аз пахш кардани роҳи PI3K-AKT, ҳуҷайраҳои назоратӣ (C) бо тавсеаи β-гурба (C') дароз шуданд, дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои kd ба апоптоз (D) монанданд, ки ба ҷанинҳои хеле мутатсияшудаи мо монанданд ва β-кати бениҳоят мукаммалро нишон доданд.ранг кардан (D').Пас аз фаъолсозии роҳи PI3K-AKT, ҳуҷайраҳои назоратӣ мукаабшакл (E) боқӣ монданд ва рангҳои муқаррарии β-кати (E') доштанд, дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои kd ранг кардани шакли ҳуҷайра (F) ва β-cat (F') ба таври назаррас беҳтаршударо нишон доданд, ки нишон медиҳад (G) Дараҷаи тағирёбии шакли ҳуҷайра дар (AF) бо истифода аз таносуби даврии ҳуҷайра (CCR) андозаи дарозтарин (дарозӣ) ва андозаи мувофиқи амудӣ (паҳно) бо истифода аз нармафзори MetaMorph муайян карда шуд.Ҳуҷайраҳои коркарднашуда (NT) SPECC1L-kd (CCR = 3.46) нисбат ба ҳуҷайраҳои назоратӣ ба таври назаррас дарозтар буданд (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Моҳияти Wort роҳи PI3K-AKT дар ҳуҷайраҳои назоратӣ барои ба вуҷуд овардани дарозии шабеҳ дар шакли ҳуҷайра кофӣ буд (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Ба ҳамин монанд, фаъолсозии AKT аз ҷониби SC-79 дар ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd дарозии ҳуҷайраро ба сатҳи назорат барқарор кард (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Табобати Вортманнин бо ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd боиси афзоиши апоптоз гардид, аммо афзоиши минбаъдаи тағирёбии шакли ҳуҷайра (CCR = 3.60) дар муқоиса бо kd коркарднашуда (CCR = 3.46, ns) ё ҳуҷайраҳои назоратии вортманнин (3.61) дар .ns = муҳим нест.+/- Андозаҳои SEM барои 50 ҳуҷайра нишон дода шудаанд.Фарқиятҳои оморӣ бо истифода аз t-testи Student ҳисоб карда шуданд.
(A) Намоиши схематикии монеъшавӣ ва фаъолсозии роҳи PI3K-AKT, ки мутаносибан тағироти AJ ва наҷотро ба вуҷуд меорад.(B) Модели пешниҳодшуда барои устуворсозии сафедаи AKT аз ҷониби SPECC1L.
CNCC-ҳои премигратсионӣ лизиси AJ-ро талаб мекунанд, ки аз ҳуҷайраҳои нейроэпителиалии қабати пешинаи асаб ҷудо шаванд1,15,32.Зиёд шудани рангкунии ҷузъҳои AJ ва талафоти тақсимоти асимметрии апикалӣ-базалии AJ дар ҳуҷайраҳои норасоии SPECC1L ҳам in vitro ва ҳам дар in vivo, дар якҷоягӣ бо наздикии ҷисмонии SPECC1L ба β-катенин, нишон медиҳанд, ки SPECC1L барои дуруст нигоҳ доштани устувории маҳаллии AJ кор мекунад. мушакҳои ташкилӣ.ситоскелети актин.Ассотсиатсияи SPECC1L бо ситоскелети актин ва β-катин ва афзоиши шумораи филаментҳои конденсатшудаи актин дар сурати набудани SPECC1L бо афзоиши мушоҳидашудаи зичии AJ мувофиқ аст.Имконияти дигар ин аст, ки афзоиши шумораи нахҳои актин дар ҳуҷайраҳои норасоии SPECC1L боиси тағирёбии шиддати байни ҳуҷайраҳо мегардад.Азбаски фишори ҳуҷайра ба динамикаи AJ 33 таъсир мерасонад, тағирёбии шиддат метавонад боиси паҳншавии бештари AJ 34 гардад.Ҳамин тавр, ҳама гуна тағирот ба қабатҳои CNCC таъсир мерасонад.
Wnt1 дар қабатҳои аввали асаб ифода карда мешавад, ки ҳуҷайраҳои крестҳои асабро ба вуҷуд меоранд.Ҳамин тариқ, пайгирии насли Wnt1-cre ҳам NCC35-и қаблӣ ва ҳам муҳоҷиратро нишон медиҳад.Бо вуҷуди ин, Wnt1 инчунин клонҳои бофтаи мағзи сарро низ нишон медиҳад, ки аз қабатҳои барвақти асаб ба даст омадаанд 35,36, ки эҳтимол дорад, ки ранг кардани мутантҳои E9.5 барои маркерҳои Wnt1 дар оғилҳои кушоди асаб CNCC нест.Рангҳои мусбии мо барои маркерҳои NCC AP2A ва SOX10 тасдиқ кард, ки қабатҳои асабии ҷанинҳои мутант Specc11 воқеан дорои CNCC мебошанд.Илова бар ин, азбаски AP2A ва SOX10 аломатҳои NCC-и барвақти муҳоҷиркунанда мебошанд, рангҳои мусбӣ нишон доданд, ки ин ҳуҷайраҳо CNCC пас аз муҳоҷират мебошанд, ки бо E9.5 стратификация карда намешаванд.
Маълумоти мо нишон медиҳад, ки танзими молекулавии AJ тавассути SPECC1L тавассути сигнали PI3K-AKT миёнаравӣ мекунад.Сигналгузории AKT дар ҳуҷайраҳо ва бофтаҳои норасоии SPECC1L коҳиш меёбад.Бозёфтҳои Фантауззо ва дигарон.нақши мустақимро барои сигнализатсияи PI3K-AKT дар морфогенези краниофасиалӣ дастгирӣ мекунад.(2014) нишон дод, ки набудани фаъолсозии сигнализатсияи PI3K-AKT дар асоси PDGFRα боиси фенотипи рахнаи рахна мегардад.Мо инчунин нишон медиҳем, ки ҷилавгирӣ аз роҳи PI3K-AKT барои тағир додани AJ ва шакли ҳуҷайра дар ҳуҷайраҳои U2OS кифоя аст.Мувофиқи бозёфтҳои мо, Қобил ва дигарон.37 нишон дод, ки коҳиши танзими зербахши PI3K α110 дар ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ боиси афзоиши шабеҳи доғи периселлюлярии β-катенин мегардад, ки онро афзоиши "индекси пайвастшавӣ" меноманд.Бо вуҷуди ин, дар ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ, ки филаментҳои актини онҳо аллакай ба таври баланд ташкил карда шудаанд, фурўхтани роҳи PI3K-AKT ба шакли ҳуҷайраи фуҷур оварда мерасонад.Баръакс, ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd U2OS шакли ҳуҷайраи дарозро нишон доданд.Ин фарқият метавонад ба намуди ҳуҷайра хос бошад.Дар ҳоле ки фурў нишондани сигнализатсияи PI3K-AKT ба ситоскелети актин ба таври доимӣ таъсир мерасонад, таъсир ба шакли ҳуҷайра бо тағирёбии шиддат, ки дар натиҷаи тағирёбии зич ва ташкили нахҳои марказии актин ба вуҷуд омадааст, муайян карда мешавад.Дар ҳуҷайраҳои U2OS, мо танҳо тағироти шакли ҳуҷайраро ҳамчун аломати тағирот ва барқарорсозии AJ-и норасоии SPECC1L истифода кардем.Дар натиҷа, мо тахмин мезанем, ки ҷилавгирӣ аз роҳи AKT дар норасоии SPECC1L устувории AJ-ро зиёд мекунад ва деламинатсияро дар CNCC коҳиш медиҳад.
Ҷолиб он аст, ки сатҳи пан-AKT дар vitro ва in vivo ба ғайр аз сатҳи фосфоришудаи 473-AKT дар сурати мавҷуд набудани SPECC1L коҳиш ёфт, ки танзими сигнализатсияи PI3K-AKT дар сатҳи устувории сафедаи AKT ё гардиши хунро пешниҳод мекунад.Генҳои SPECC1L ва MID1, ки ҳарду бо синдроми Opitz / GBBB алоқаманданд, сафедаҳоеро рамзгузорӣ мекунанд, ки микротубулҳоро устувор мекунанд 18,22.Механизме, ки тавассути он SPECC1L ва MID1 миёнаравӣ барои мӯътадилсозии микротюбулҳо пурра фаҳмида нашудааст.Дар мавриди SPECC1L, ин мӯътадилшавӣ ацетилизатсияи мукаммали як маҷмӯи микротубулҳо 18-ро дар бар мегирад.Мумкин аст, ки SPECC1L механизми шабеҳро барои устувор кардани сафедаҳои дигар, ба монанди AKT истифода мебарад.Исбот шудааст, ки ацетилизатсияи пасмондахои лизин дар сафедаи АКТ боиси паст шудани локализатсияи мембрана ва фосфоризатсия мегардад38.Илова бар ин, убиквитинатсияи занҷири K63 дар ҳамон боқимондаи лизин дар AKT барои ҷойгиршавӣ ва фаъолсозии мембранаи он зарур аст39,40.Дар байни якчанд омилҳои мутақобила бо сафедаҳои SPECC1L, ки дар экранҳои гуногуни хамиртуруши ду гибридии гузаранда муайян шудаанд, чорто - CCDC841, ECM2942, APC ва UBE2I43 - ба гардиши сафедаҳо ё устуворӣ тавассути ubiquitination ё сумойлизатсия алоқаманданд.SPECC1L метавонад дар тағир додани пас аз тарҷумаи пасмондаҳои лизини AKT, ки ба устувории AKT таъсир мерасонад, ҷалб карда шавад.Бо вуҷуди ин, нақши муҳими SPECC1L дар локализатсия ва устувории сафедаи AKT бояд равшан карда шавад.
Камбудиҳои ҷиддии ифодаи SPECC1L дар vivo боиси зиёд шудани доғи маркери AJ ва қабати ноқиси CNCC, инчунин афзоиши апоптоз ва марги барвақти ҷанин шуданд.Гузоришҳои қаблӣ нишон доданд, ки мутантҳои муш бо сатҳи баланди апоптоз бо нуқсонҳои найҳои асаб 44,45,46,47 ва нуқсонҳои краниофасиалӣ48 алоқаманданд.Пешниҳод шудааст, ки марги аз ҳад зиёди ҳуҷайраҳо дар қабатҳои асаб ё камонҳои ҳалқ метавонад ба миқдори нокифояи ҳуҷайраҳо барои ҳаракати дурусти морфогенетикӣ 48,49,50 оварда расонад.Баръакси ин, хатҳои ҳуҷайраи норасоии SPECC1L бо ифодаи мӯътадил коҳишёфтаи SPECC1L танҳо тағироти AJ-ро бидуни далели афзоиши марги ҳуҷайра нишон доданд.Аммо, монеаи кимиёвии роҳи PI3K-AKT дар ин ҳуҷайраҳои Kd боиси афзоиши апоптоз гардид.Ҳамин тариқ, коҳиши мӯътадили ифода ё функсияи SPECC1L зинда мондани ҳуҷайраҳоро таъмин мекунад.Ин ба мушоҳида мувофиқ аст, ки ҷанинҳои нодири мутант Specc11, ки аз ҳабс дар ст.E9.5 - шояд аз сабаби кам шудани самаранокии забти генҳо - қодиранд найҳои асабии худро пӯшанд ва дертар инкишофро қатъ кунанд, аксар вақт бо нуқсонҳои краниофасиалӣ (расми S3).Инчунин ба ин падидаи нодири ҷанинҳои гетерозиготии Specc1l бо нуқсонҳои краниофасиалӣ мувофиқат мекунад - эҳтимол аз сабаби зиёд шудани самаранокии гирифтани ген - инчунин дарёфти дар зебравӣ, ки дар он яке аз ду ортологҳои SPECC1L (specc1lb) боиси фенотипҳои дер ҷанин, аз ҷумла гум шудани ҷанин мегардад. даҳони поён ва рахҳои дутарафа51.Ҳамин тариқ, мутатсияҳои гетерозиготии аз даст додани функсияи SPECC1L, ки дар беморони инсон муайян карда шудаанд, метавонанд дар функсияи SPECC1L ҳангоми морфогенези краниофасиалӣ халалдор шаванд, ки барои шарҳ додани рахҳои оро-фасиалии онҳо кофӣ мебошанд.Танзими ба SPECC1L асосёфтаи алоқаҳои байниҳуҷайравӣ низ метавонад дар палатогенез ва омезиши камонҳои ҳалқӣ нақш бозад.Тадқиқоти минбаъдаи функсияи SPECC1L барои равшан кардани нақши алоқаҳои муваққатии байниҳуҷайравӣ дар CNCC ҳангоми бастани найҳои асаб дар ҳаракати ҳуҷайраҳои нейроэпителиалӣ ва морфогенези краниофасиалӣ кӯмак хоҳад кард.
Назорати остеосаркомаи U2OS ва ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd қаблан тавсиф шуда буданд (Саъдӣ ва дигарон, 2011).Антителоҳо бар зидди SPECC1L низ қаблан тавсиф шуда буданд (Саъдӣ ва дигарон, 2011).Антиденоҳои зидди β-катин (харгӯш; 1:1000; Санта Круз, Даллас, Техас) (муш; 1:1000; Технологияи сигнализатсияи ҳуҷайра, Данверс, MA), миозин IIb (1:1000; Сигма-Олдрих, Сент-Луис ), MO)), E-cadherin (1:1000; Абкам, Кембридж, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Коло.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан Диего) , Калифорния), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Технологияи сигнализатсияи ҳуҷайра, Данверс, MA), каспази 3 (1: 1000; Технологияи сигнализатсияи ҳуҷайра, Данверс, MA) ва β-актин (1: 2500; Сигма-Олдрих, Сент-Луис, MO ) тавре ки тавсиф карда шудааст, истифода мешуд..Филаментҳои актин бо phalloidin rhodamine Acti-stain (Cytoskeleton, Денвер, Колорадо) ранг карда шуданд.
Ҳуҷайраҳои назоратии U2OS ва ҳуҷайраҳои SPECC1L-kd дар DMEM-и стандартии глюкозаи баланди хун, ки бо 10% хунобаи гови ҳомила илова карда шудаанд (Life Technologies, Карлсбад, CA).Барои тағирёбии AJ, 2 x 105 ҳуҷайра дар шишае, ки бо желатини хуки 0,1% коркард шудааст (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО) тухмипошак карда шуд ва барои тағирёбии шакли ҳуҷайра мушоҳида карда шуд.Ҳуҷайраҳо дар нуқтаҳои гуногуни вақти зикршуда ҷамъоварӣ карда шуданд: 4 соат пас аз тухмӣ (t = 1), 24 соат пас аз тухмӣ (t = 2), пайвастан бе тағир дар шакли ҳуҷайра (t = 3), тағирёбии шакли ҳуҷайра (t = 4) , 24 соат пас аз тағирёбии шакли ҳуҷайра (t = 5) ва 48 соат пас аз тағирёбии шакли ҳуҷайра (t = 6) (расми 1, 2, 3).Барои модул кардани роҳи PI3K-AKT, ҳуҷайраҳо дар консентратсияи нишондодашуда бо ингибитори PI3K-AKT вортманнин (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис, Миннесота) ё фаъолкунандаи SC-79 (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис Адамс, Миннесота) парвариш карда шуданд.Муҳити дорои моддаҳои кимиёвӣ ҳар рӯз иваз карда мешуд.
Сабтҳои чаҳорчӯба ба чаҳорчӯба дар ҳуҷайраҳои назорати зинда ва KD дар шароити фарҳанги муқаррарӣ анҷом дода шуданд ва тасвирҳои контрасти марҳилавӣ ҳар 10 дақиқа барои 7 рӯз ҷамъоварӣ карда шуданд.Тасвирҳо бо истифода аз микроскопи инверсионии Leica DM IRB, ки бо компютер идорашаванда бо марҳилаи механикӣ ва ҳадафи 10 × N-PLAN, ки ба камераи QImaging Retiga-SRV пайваст шудааст, ба даст оварда шуданд.Ҳангоми тасвир, фарҳангҳои ҳуҷайра дар 37 ° C дар атмосфераи намӣ бо 5% CO2 нигоҳ дошта шуданд.
Ду хатти ҳуҷайраи гении доми ES DTM096 ва RRH048 аз Маркази манбаи минтақавии Мутанти Мутант (UC Davis, CA) барои тавлиди хатҳои муши норасои Specc11, ки Specc1lgtDTM096 ва Specc1lgtRRH046 таъин шудаанд, истифода шуданд.Ба таври мухтасар, ҳуҷайраҳои 129/REJ ES ба бластоцистҳои C57BL6 ворид карда шуданд.Мушҳои марди химерӣ бо мушҳои зан C57BL6 парвариш карда шуданд, то наслро бо ранги куртаи агути муайян кунанд.Барои муайян кардани гетерозиготаҳо мавҷудияти векторҳои вектори доми ген истифода мешуд.Мушҳо дар заминаи омехтаи 129/REJ;C57BL6 нигоҳ дошта шуданд.Ҷойгиршавии макони ҷойгиркунии вектори доми генетикӣ бо RT-PCR, пайдарпайии геном ва комплеменсияи генетикӣ тасдиқ карда шуд (Расми иловагӣ 1).Барои пайгирии насли CNCC мушҳои дукаратаи гетерозиготаи Specc1lGT, мушҳои ROSAmTmG (# 007576) ва Wnt1-Cre (# 003829) (Лабораторияи Ҷексон, Бар Харбор, ME) барои тавлиди ROSAmTmG ва Wnt1-Cre аллеленти мутатсияҳои Specbryo-ро убур карданд.Ҳама таҷрибаҳо дар мушҳо мувофиқи протоколҳое, ки аз ҷониби Кумитаи нигоҳубин ва истифодаи ҳайвоноти институтсионалии Маркази тиббии Донишгоҳи Канзас тасдиқ шудаанд, гузаронида шуданд.
Ҷанинҳо дар (1% формальдегид, 0,2% глутаральдегид, 2 мм MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мм EGTA) барои 60 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ ҷойгир карда шуданд.Пас аз фиксатсия дар маҳлули рангкунии X-gal (5 мм феррицианиди калий, 5 мм ферросианиди калий, 2 мм MgCl2, 0,01% дезоксихолати натрий, 0,02% NP-40, 1 мг/мл X-gal) Рушди доғ дар ҳарорати 337°C анҷом дода шуд. .°C дар давоми 1-6 соат.Ҷанинҳо дар 4% PFA пас аз ислоҳ карда шуданд ва визуалӣ карда шуданд.
Барои blotting Western, ҳуҷайраҳо дар буфери пассивии лизис (Promega, Fitchburg, WI) бо омехтаи ингибиторҳои протеазаи HALT (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO) илова карда шуданд.Лизатҳо дар гелҳои тайёри 12% полиакриламиди Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) коркард шуда, ба мембранаҳои Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA) интиқол дода шуданд.Мембранаҳо дар шири 5% дар PBS дорои 0,1% Tween баста шуданд.Антиденоҳо дар як шабонарӯз дар 4 ° C ё як соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд.Reagent Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) барои тавлиди сигнал истифода шудааст.Барои иммуностинг, ҷанинҳо дар як шабонарӯз дар 4% PFA/PBS ҷойгир карда шуданд ва криоконсерватсия карда шуданд.Криосекцияҳои матоъ дар PBS, ки дорои 1% хунобаи муқаррарии буз (Thermo Scientific, Waltham, MA) ва 0,1% Triton X-100 (Sigma-Oldrich, Сент-Луис, МО) маҳкам карда шуданд ва сипас дар инкубатор дар давоми 4°C инкубатор карда шуданд. шаб.бо антитело ва антитело дуюмдараҷаи флуоресцентӣ (1:1000) барои 1 соат дар 4°С.Қисмҳои рангшуда дар муҳити тиллоии ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) ҷойгир карда шуданд ва тасвирҳои ҳамвор бо истифода аз микроскопи конфокалии Leica TCS SPE гирифта шуданд.Ҳар як рангкунии иммунӣ ҳамчун се таҷрибаи мустақил оид ба цироссекцияҳои ҳадди аққал ду ҷанини мутант анҷом дода шуд.Таҷрибаи намояндагӣ нишон дода шудааст.
Ҳуҷайраҳо дар буфери тағирёфтаи RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% глицерин, 2 мм EDTA ва ингибитори протеазаи HALT (Сигма-Алдрих, Сент-Луис, MO) инкубатсия карда шуданд. Хулоса, лизатҳо бо маҳтобҳои магнитии протеини G (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) пешакӣ тоза карда шуданд ва сипас дар як шабонарӯз дар 4 ° C инкубатсия карда шуданд. бо маҳтобҳои сафедаи зидди SPECC1L ё IgG протеини G барои истихроҷи SPECC1L истифода шуданд ва blotting Western бо истифода аз анти Антиденои -β-катенин, ки дар боло тавсиф шудааст, таҷрибаҳои co-IP нишон дода шудаанд, намояндаи чор таҷрибаҳои мустақил мебошанд.
Ҳуҷайраҳои парваришшудаи собит ё бофтаҳои ҷанинии муш ба маркази микроскопияи электронии Маркази тиббии Донишгоҳи Канзас дода шуданд.Ба таври мухтасар, намунаҳо дар қатрони EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Форт Вашингтон, PA) ҷойгир карда шуданд, дар як шабонарӯз дар 60 ° C полимеризатсия карда шуданд ва дар 80 нм бо истифода аз ултрамикротомии Leica UC7, ки бо майсаи алмос муҷаҳҳаз шудааст, тақсим карда шуданд.Қисмҳо бо истифода аз микроскопи электронии интиқоли JEOL JEM-1400, ки бо таппончаи 100 кВ Lab6 муҷаҳҳаз шудаанд, намоиш дода шуданд.
Чӣ тавр ба ин мақола иқтибос овардан мумкин аст: Вилсон, НР ва дигарон.Норасоии SPECC1L ба зиёд шудани устувории буғумҳои ҷудошуда ва кам шудани деламинатсияи ҳуҷайраҳои крани асабӣ оварда мерасонад.илм.6, 17735;дои: 10.1038/srep17735 (2016).
Сент-Жан, Ҷ.-П.Индуксия ва дифференсиатсияи қуллаи асаб.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Кордеро, ДР ва дигарон.Ҳуҷайраҳои крани асаб дар ҳаракат: нақши онҳо дар рушди краниофасиалӣ.Маҷаллаи амрикоии генетикаи тиббӣ.Қисми A 155A, 270–279, дои: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, RP Neurocristopathia: афзоиш ва рушди он дар тӯли 20 сол.Педиатр.патология.лаборатория.дорувори.17, 1–25 (1997).
Манголд Э., Людвиг К.У ва Нотен М.М. Пешрафт дар генетикаи рахи рӯдаи рӯда.Тамоюлҳо дар тибби молекулавӣ 17, 725-733, дои: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Мину, М. ва Райли, ФМ Механизмҳои молекулавии муҳоҷирати ҳуҷайраҳои краниалии асабӣ ва намунасозӣ ҳангоми рушди краниофасиалӣ.Рушди 137, 2605–2621, дои: 10.1242/dev.040048 (2010).
Диксон, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ва Murray, JK Cleft лаб ва ком: фаҳмиши таъсири генетикӣ ва муҳити зист.шарҳи табиӣ.Генетика 12, 167-178, дои: 10.1038/nrg2933 (2011).
Инграм, CR ва дигарон.Морфогенези ғайримуқаррарии пӯст, дастҳо ва минтақаи краниофасиалӣ дар мушҳои нокифояи омили танзимкунандаи интерферон-6 (Irf6).Миллии Генет.38, 1335–1340, дои: 10.1038/ng1903 (2006).
Пейрард-Чанвид, М.Мутацияҳои бартаридошта дар GRHL3 боиси синдроми ван дер Ваорд мешаванд ва рушди перидермаи даҳонро халалдор мекунанд.Am J Hum Genet 94, 23-32, дои: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Ҳаррис, MJ ва Juriloff, DM Рӯйхати мутантҳои мушро бо нуқсонҳо дар бастани найҳои асаб навсозӣ кунед ва дар самти фаҳмиши пурраи генетикии баста шудани найчаи асаб пешравӣ кунед.Тафтиши нуқсонҳои таваллуд.Қисми А, Тератологияи клиникӣ ва молекулавӣ 88, 653–669, дои: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Сигналгузории PDGFRalpha тавассути PI3K миёнаравӣ зиндамонӣ ва паҳншавии скелетро тавассути роҳи дохили ҳуҷайраҳои аз p53 вобаста танзим мекунад.Рушди ген 28, 1005–1017, дои: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Копп, AJ, Грин, НД ва Мердок, Ҷ.Н. Дишевелед: Муносибати васеъшавии конвергентӣ ба бастани найҳои асаб.Тамоюлҳо дар неврология.26, 453–455, дои: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).