310 10 * 1мм ҷузъҳои кимиёвии қубури аз пӯлоди зангногир печонидашуда, Доменҳои N-терминали спидроин гидрогелҳоро дар асоси фибрилҳои амилоид ташкил медиҳанд ва платформаи иммобилизатсияи сафедаҳоро фароҳам меоранд.

Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Слайдерҳо се мақоларо дар як слайд нишон медиҳанд.Барои гузаштан дар слайдҳо тугмаҳои қафо ва ояндаро истифода баред ё тугмаҳои контролери слайдро дар охири ҳар як слайд ҳаракат кунед.

Мушаххасот

310 10 * 1mm аз пӯлоди зангногир таъминкунандагони tubing coiled

Таркиби химиявӣ

Хусусиятҳои механикӣ

Протеинҳои рекомбинатии абрешими тортанак (протеинҳои абрешими тортанак) дар таҳияи биоматериалҳои нав барномаҳои зиёди потенсиалӣ доранд, аммо табиати мултимодалӣ ва ба ҷамъшавӣ майл доштани онҳо ба даст овардани онҳоро мушкил ва истифодаи осон мегардонад.Дар ин ҷо мо гузориш медиҳем, ки протеинҳои рекомбинатии миниатюрии спидроин ва муҳимтар аз ҳама, худи домени N-терминал (NT) дар ҳарорати 37 °C зуд гидрогелҳои худтаъминкунанда ва шаффофро ташкил медиҳанд.сафедаҳои синтез, ки аз NT ва сафедаи сабзи флуоресцентӣ ё фосфорилазаи пурин нуклеозид иборатанд, сафедаҳои синтези пурра функсионалӣ ташкил медиҳанд.Гидрогельхо.Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки протеинҳои рекомбинатии NT ва синтез ҳосили баланди экспрессияро таъмин мекунанд ва ба гидрогелҳо хосиятҳои ҷолибе ба монанди шаффофият, гелатсия бидуни пайвастшавӣ ва иммобилизатсияи мустақими сафедаҳои фаъол дар зичии баланд медиҳанд.
Тортанакҳо то ҳафт маҷмӯи гуногуни ғадудҳои абрешим доранд, ки ҳар кадоми онҳо як намуди махсуси абрешимро истеҳсол мекунанд.Ҳама ҳафт намуди абрешим аз сафедаҳои абрешими тортанакҳо (спидроинҳо) тақрибан 6000 боқимонда иборатанд ва дорои як минтақаи калони такрории марказӣ, ки бо доменҳои кураи N- ва C-терминалҳо иҳота шудаанд (NT ва CT)1,2.Навъи аз ҳама васеъ омӯхташудаи абрешим, ампулаи аввалияро ғадуди ампулаи аввалия истеҳсол мекунад.Дар ин ғадуд як қабати ҳуҷайраҳои эпителиалӣ сафедаҳои спидроинро синтез карда, онҳоро ба люмени ғадуд ҷудо мекунад, ки дар он дар шакли ҳалшаванда (допинг) дар консентратсияи ниҳоят баланд (30-50% в/в) мавҷуд аст3,4.Ташкил ва конформатсияи сафедаҳои асосии ампулярии спидроин дар ғадуд мавриди баҳс қарор гирифтаанд, аммо аксари далелҳои таҷрибавӣ мавҷудияти конформатсияи спидриалӣ ва/ё тасодуфӣ ва сохторҳои мицеллярӣ ё ламелляриро нишон медиҳанд5,6,7,8,9,10.Дар ҳоле ки доменҳои такрорӣ хосиятҳои механикии нахҳои абрешимро танзим намуда, нанокристаллҳои β-варақ ва сохторҳои аморфӣ11,12,13,14,15, доменҳои ниҳоӣ нахҳои абрешимро дар ҷавоб ба шароити тағйирёбандаи ғадуди абрешим танзим мекунанд16,17,18.Бо назорати ташаккули абрешим, 19. Доменҳои терминалӣ ба таври эволютсионӣ нигоҳ дошта мешаванд ва вазифаи онҳо метавонад барои ҳама сафедаҳои спидроин умумӣ бошад 2,20,21.Ҳангоми гузаштан аз ғадуд, рН-и спидроин тақрибан аз 7,6 то <5,716 коҳиш меёбад ва бо буридан ва дарозшавӣ тавассути ҳаракат тавассути канали тадриҷан танг мешавад.Дар маҳлул, CT як димери мувозии α-спирали конститутсионӣ17 мебошад, аммо дар посух ба қувваҳои пасти рН ва буридан, КТ ифшо мешавад ва β-қабатҳоро иваз мекунад16, 17, эҳтимолан β-қабатҳоро дар минтақаҳои такроршавандаи Convert 16 ангеза медиҳад. NT дар зери мономерӣ мебошанд. шароитҳое, ки шароитро дар люмени ғадуди ғадуд инъикос мекунанд ва ҳалшавандагии спидроинро миёнаравӣ мекунанд, аммо ҳангоми паст шудани рН, протонатсияи як қатор занҷирҳои паҳлӯии кислотаи карбон боиси димеризатсияи NT бо pKa тақрибан 6,5 мегардад ва ба ин васила NT-ро мӯътадил мегардонад ва спидроинро дар ҳаҷми калон нигоҳ медорад. миқдор.шабакаҳо16,18.Ҳамин тариқ, NT дар ташаккули филамент нақши калидӣ дорад, ки аз мономер дар пӯшиш ба димер дар нах табдил меёбад23,24,25.NT дар ҳама шароите, ки то имрӯз омӯхта шудааст16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 хеле ҳалшаванда ва спиралӣ боқӣ мемонад, ки ба рушди он ҳамчун нишони баландбардории ҳалшаванда барои истеҳсоли сафедаҳои гетерологӣ илҳом бахшид.
Протеини абрешими рекомбинати хурди тортанаккана, ки аз як NT, як минтақаи такрории кӯтоҳ, як CT ва теги His6 (His-NT2RepCT) барои тозакунӣ иборат аст, ба мисли протеини абрешими тортанаки модарӣ дар буфери обӣ ҳал мешавад ва ба хусусиятҳои муҳими аслии тортанакҳои абрешим тақлид мекунад. .фарогирии 25.31.His-NT2RepCT-ро бо истифода аз мошини биомиметикӣ ба нахҳои муттасил табдил додан мумкин аст, ки дар он қабати ҳалшавандаи pH 8 ба ваннаи обии pH 525,32,33,34,35 экструдсия карда мешавад.Ферментатсияи биореактори E. coli, ки His-NT2RepCT-ро ифода мекунад ва пас аз табобат пас аз тозакунӣ ҳосили >14 г/л ба даст овард.Ҳосили баланд, ҳалшавандагии баланд ва вокуниши мувофиқи His-NT2RepCT ба шароити туршӣ ҳама ба NT23, 25, 34 мансубанд.
Дар ин ҷо мо дар бораи ташаккули босуръати гидрогелҳои шаффоф аз сафедаҳои рекомбинатии спидроин, аз ҷумла танҳо NT, тавассути инкубатсияи маҳлули сафеда дар 37 ° C гузориш медиҳем.Бо истифода аз флуорессенсияи тиофлавин Т (ThT), Фурье спектроскопияи инфрасурх (FTIR), спектроскопияи магнитии резонанси ядроӣ (NMR) ва микроскопияи электронии интиқол (TEM), мо дарёфтем, ки сафедаҳои NT ва микроортанакҳо ба β-варақҳо ва фибрилҳои амилоид монанд табдил меёбанд. вақте ки гелҳо ба вуҷуд меоянд.Илова бар ин, сафедаҳои синтези NT ва сафедаи сабзи флуоресцентӣ (GFP) ё фосфорилазаи пурин нуклеозид (PNP) гидрогелҳоро бо порчаҳои синтези комилан функсионалӣ ташкил медиҳанд.Ифодаи сермахсул дар мизбонхои гетерологй, ки бо хосил шудани босуръати гидрогелхо дар шароити физиологй, имкони-яти камхарч истехсол кардани гидрогельхоро бо вазифахои инженерй ба вучуд меоварад.
Бар хилофи аксари сафедаҳои рекомбинантии спидроин36, His-NT2RepCT дар буфери Tris-HCl дар pH 8 устувор аст ва метавонад то 500 мг/мл бидуни боришот мутамарказ карда шавад25.Аз ин рӯ, мо дар ҳайрат мондем, ки ин сафеда ҳангоми инкубатсия дар 37°С зуд гидрогелҳои аз ҷиҳати оптикӣ равшан ва худтаъминкунандаро ба вуҷуд меорад (расми 1б-д).Таҳқиқоти минбаъда нишон доданд, ки гелатсияи His-NT2RepCT дар доираи васеи консентратсияи сафедаҳо (10-300 мг/мл) ба амал омадааст ва ин консентратсия бо вақти гелатсия алоқамандии баръакс дорад (расми 1c ва расми иловагӣ 1).Барои фаҳмидани он, ки кадом қисмҳои His-NT2RepCT дар ташаккули гидрогел миёнаравӣ мекунанд, мо пас аз он ҳар як доменро дар алоҳидагӣ ва дар таркиби гуногун бо истифода аз таҳлили инверсияи колба тафтиш кардем (Расми 1a, b).Ҳама фраксияҳои санҷидашудаи спидроини рекомбинантӣ гелҳо ташкил карданд (дар консентратсияи сафедаи 300 мг/мл) дар давоми камтар аз 1 соат, ба истиснои 2Реп преципитация (расми 1б).Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки танҳо NT ва CT дар якҷоягӣ ё бо такрорҳо алоқаманд метавонанд дар 37 ° C гел шаванд ва теги His6 ба ин раванд то андозае таъсир намерасонад.Бо дарназардошти мафҳуми маъмул дар бораи он, ки NT як сафедаи хеле ҳалшаванда ва устувор аст ва гузоришҳои қаблии гидрогелҳои рекомбинатии спидроин таъсири гелатсияро ба тағирёбии конформатсия дар минтақаҳои такрорӣ ва/ё КТ марбут кардаанд, худи NT метавонад.Кашфи гелация гайричашмдошт буд.Ҷадвали иловагӣ 1) 37, 38, 39. Ҷолиб он аст, ки NT аллакай дар давоми 10 дақиқа дар консентратсияи ≥ 300 мг/мл гел шуда буд (расми 1c).Таҷрибаҳои инверсияи шиша бо консентратсияи гуногуни NT нишон доданд, ки дар >50 мг/мл маҳлули NT нисбат ба His-NT2RepCT дар консентратсияи мувофиқ тезтар гел мешавад (w/v, Расми 1c).
Намоиши схематикии конструкцияхои гуногуни спидроин, ки дар ин кор омухта шудаанд.b Вақти гель дар 37 °C барои протеинҳои гуногуни рекомбинатии спидроин (300 мг/мл), ки бо тағир додани шиша тасдиқ карда шудааст.Гели CT фавран бе инкубатсия (<300 мг/мл), боришотҳои 2Реп (300 мг/мл, миқёси 5 мм).в Вақти гелии His-NT2RepCT ва NT дар консентратсияи сафедаи нишондодашуда дар 37°C.d Суратҳои гидрогелҳои His-NT2RepCT ва NT бо тортанак ва ҳарфи "NT" дар зер чоп шудаанд (ҳарду 200 мг/мл, сатри миқёси 5 мм).
Гидрогелхое, ки аз протеинхои гуногуни рекомбинатии спидроинхо хосил мешаванд, рангхои каме гуногун доранд ва мушохидаи чашми барахна дарачахои гуногуни шаффофиятро нишон медихад (расми 1б).Гельҳои NT бениҳоят равшананд, дар ҳоле ки дигар гелҳо ношаффоф мешаванд.Гелҳои His-NT2RepCT ва NT-ро, ки ба қубурҳои силиндрӣ андохта шудаанд, аз қолаби солим хориҷ кардан мумкин аст (расми 1d).
Барои санҷидани он, ки оё пӯшишҳои абрешими тортанакҳои табии дар шароите, ки ҳоло муайян шудаанд, ки боиси гелизатсияи сафедаҳои рекомбинатии спидроин мешаванд, аз ғадуди ампулаи калони тортанакҳои пулии Шветсия (Larinioides sclopetarius) пӯшишҳо ҷамъоварӣ карда шуданд.Пӯшишҳо дар буфери 20 мм Tris-HCl дар 50 мг/мл нигоҳ дошта шуданд (дар асоси вазни хушки ченшуда), аммо дар давоми инкубатсияи 21 рӯз дар 37 °C ҳеҷ гуна гелатсия мушоҳида нашудааст (Расми иловагӣ 2a).
Барои муайян кардани миқдори ин гелҳо, ченакҳои реологиро барои омӯхтани раванди гелатсия ва муайян кардани хосиятҳои умумии механикӣ истифода бурдан мумкин аст.Аз ҷумла, мониторинги модули нигоҳдорӣ (эластикӣ) дар ҳарорати баланд метавонад маълумотро дар бораи ҳарорати гелшавӣ ва инчунин хосиятҳои часпакии рӯйпӯш таъмин кунад.Таҷрибаҳои баланд бардоштани ҳарорат (бо истифода аз 1°C/дақ дар 25-45°C, дар асоси таҳқиқоти қаблӣ бо истифода аз маҳлулҳои абрешими табиӣ)40,41 нишон доданд, ки модулҳои нигоҳдории маҳлулҳои His-NT2RepCT ва NT бо афзоиши ҳарорат зиёд мешаванд.зиёд карда шуд (расми 2 ва расми 3).Қобили зикр аст, ки модули NT дар муқоиса бо His-NT2RepCT дар ҳарорати пасттар афзоиш ёфт, ки ба вақти зудтари гел мушоҳидашуда, вақте ки NT мустақиман бо His-NT2RepCT дар 37°C инкубатсия карда шуд (расми 1).Пас аз пастшавии минбаъдаи ҳарорат, модули нигоҳдорӣ ба арзишҳои пасттар барнагашт ва аз модули талафот болотар монд (ниг. Ба расми 3), ки ин нишон медиҳад, ки гелатсияи устувори термикӣ бебозгашт.Пас аз гелизатсия, модули ниҳоии чандирӣ барои гидрогелҳои His-NT2RepCT аз 15 то 330 кПа дар консентратсияи 100–500 мг/мл ва модули ниҳоии чандирии гидрогелҳои NT (100–500 мг/мл) аз 2 то 1400 буд. кПа (расми , 2 ва маълумоти пурраи пандус) ба расми иловагӣ нигаред. 3).
a Тағйирёбии ҳарорат ҳангоми ченкунии His-NT2RepCT (300 мг/мл) ва b NT (300 мг/мл) бо ларзиш.Тирчаҳо тамоюли ҳароратро нишон медиҳанд ва сояҳои сабуктари маълумоти модули нигоҳдорӣ санҷишро дар арзишҳои моменти камтари асбоб нисбат ба нишондодаи истеҳсолкунанда нишон медиҳанд, ки сабаби баланд шудани садо мебошад.c Ҷамъшавии охири модули His-NT2RepCT ва NT пас аз ҳарорати баланд (100, 300 ва 500 мг/мл).Ҳама хонишҳои модул дар басомади 0,1 Гц гирифта мешаванд.
Ҳамчун як усули эҳтимолии таҳқиқи тағироти конформатсионӣ, ки бо гелатсия алоқаманд аст, мо спектрҳои FTIR-и His-NT2RepCT ва NT-ро пеш аз ва баъд аз гелатсия дар 37 ° C сабт кардем (Расми 3a, b).Тавре ки интизор мерафт, спектрҳои маҳлулҳои His-NT2RepCT ва NT ба сафедаҳое мувофиқат карданд, ки сохтори дуюмдараҷаи α-спирал/коилки тасодуфӣ бо банди баръало дар 1645 см-1 доранд.Барои ҳарду гидрогелҳо дар натиҷаи гелатсия ду даст дар банди мобайни I дар тақрибан 1617 см-1 ва 1695 см-1 пайдо шуданд (расми 3а, б, ки ташаккули сохторҳои зидди параллели β-варақро нишон медиҳад.Ин тағиротро дар спектрҳои ҳосилшудаи дуюм ва фарқияти гелатсия низ равшан дидан мумкин аст (Расми 4б).Ду бандҳои қабати NT β-қабат нисбат ба Ҳис-NT2RepCT равшантар буданд, ки нишон медиҳад, ки миқдори умумии бандҳои β-қабат дар гидрогели NT нисбат ба гидрогели NT2RepCT баландтар буд.
спектри азхудкунии FTIR аз His-NT2RepCT ва b NT (ҳарду 500 мг/мл) пеш аз (маҳлул) ва пас аз (гел) инкубатсия дар 37°C.в Тасвирҳои TEM аз gelҳои дубора боздошташудаи 50 мг/мл NT2RepCT ва d NT.Сатри миқёс 200 нм.д Диаметрҳои нахи гидрогелҳои His-NT2RepCT ва NT.n = 100 фибрилҳои ченшуда, p <0,0001.Сатри хатогиҳо инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.Маркази сатрҳои хато миёна аст.Барои таҳлили оморӣ санҷиши ҷудонашавандаи t (ду думдор) истифода шуд.f ThT флуоресцентсияи сафедаҳои гуногуни рекомбинатии спидроин (100 мг/мл) дар 37 °C бидуни ларзиш.g NT (100 мг/мл) таҷрибаҳои эмкунӣ аз 100 мг/мл gel NT бо тухмиҳои 0%, 5%, 10% ва 20%.
Тахлили гель бо ёрии микроскопияи электронии трансмиссионй (ТЭМ) нишон дод, ки гидрогел аз фибрилхои амилоидмонанд иборат аст (расми 3в, 3г).Фибрилҳои аз NT ташаккулёфта дароз (диаметри 5-12 нм) ва шоха надоштанд, дар ҳоле ки фибрилҳои His-NT2RepCT дарозӣ кӯтоҳтар ва диаметраш ба таври назаррас васеътар буданд (7-16 нм) (расми 3e).Ин натиҷаҳо ба мо имкон доданд, ки бо истифода аз таҳлили тиофлавин T (ThT) кинетикаи фиброзро пайгирӣ кунем.Барои ҳама сафедаҳои рекомбинатии спидроин, сигнали флуоресцентӣ ҳангоми инкубатсияи намунаҳо дар 37 °C афзоиш ёфт (расми 3f, Расми 5а).Мувофиқи ин бозёфт, ташхиси микроскопии NT ва His-NT2RepCT дар шароити gelling афзоиши якхелаи флуорессенсияи ThT-ро бидуни ҷамъшавии назарраси маҳаллии агрегатҳои ThT-мусбат муайян кард (Расми 5b, c).Ташаккули фибрилҳои мусбати ThT бо афзоиши ғафсшавии NT ва Ҳис-NTCT ҳамроҳ набуд (Расми 5d), ки ин маънои онро дорад, ки шабакаи фибрилҳо дар гел бидуни осеб дидани шаффофияти гел метавонад ба вуҷуд ояд.Кишти тухмӣ тавассути илова кардани миқдори ками фибрилҳои қаблан ташаккулёфта метавонад ташаккули фибрилҳои баъзе амилоидҳоро ба таври назаррас суръат бахшад42,43,44, аммо ба маҳлули гидрокоагулянтҳои NT илова кардани 5%, 10% ё 20% (w/w) NT.таъсири тухмипошак (расми 3g).Шояд ин аз он сабаб бошад, ки фибрилҳо дар гидрогел нисбатан мустаҳкаманд ва онҳоро ҳамчун тухм истифода бурдан мумкин нест.
Рафтори ғайричашмдошти сафедаҳои рекомбинантии спидроин дар ҳарорати баланд ба таҳқиқоти минбаъдаи спектроскопияи резонанси магнитии ядроӣ (NMR) барои муайян кардани тағиротҳои конформатсионӣ, ки бо ташаккули гел алоқаманданд, водор сохт.Спектрҳои NMR-и маҳлулҳои His-NT2RepCT, ки бо мурури замон дар 37 ° C сабт шудаанд, нишон доданд, ки CT ҳанӯз қисман печонида шудааст, дар ҳоле ки сигналҳои NT ва 2Rep нопадид шудаанд (расми 4а), аз он шаҳодат медиҳад, ки он асосан NT ва 2Rep буд, ки ташаккули Ҳис-ро қисман назорат мекунад. Гидрогели NT2RepCT.Сигнали CT инчунин то 20% шиддати аслии худ суст карда шуд, ки ин нишон медиҳад, ки КТ низ асосан собит ва ба сохтори гидрогел дохил карда шудааст.Барои як қисми камтари КТ, ки мисли намунаи пеш аз инкубатсияшуда мобилӣ аст ва аз ин рӯ бо маҳлули NMR мушоҳида мешавад, спектрҳо барои 10 пасмондаҳои сохтории аввал сигнал надоранд, эҳтимол аз сабаби иммобилизатсияи душвори қисми замимашудаи His-NT2Rep.Спектрҳои ЯМР-и -ҳолати гидрогелҳо -NT2RepCT мавҷудияти бартаридоштаи α-спиралҳо ва β-қабатҳо ва то андозае конформатсияи тасодуфии чархҳоро ошкор намуд (расми 4б).Таҳлили тағирёбии кимиёвии пасмондаҳои метионин танҳо дар NT нишон дод, ки ин домен ба сохтори β-варақ табдил ёфтааст.Спектрҳои аз вақт вобастаи НТ дар маҳлул коҳиши якхелаи шиддатнокии сигналро нишон доданд (расми 4в) ва NMR-и ҳолати сахти гидрогелҳои НТ нишон дод, ки аксари боқимондаҳои НТ ба сохторҳои β-варақ табдил ёфтаанд (расми 4г).Мутобиқати 2Rep аз сабаби тамоюли ҷамъшавӣ ба таври алоҳида муайян карда намешавад.Аммо, спектрҳои ҳолати сахти NMR-и гидрогелҳои NTCT ва His-NT2RepCT ба ҳам монанд буданд (Расми 4b; Расми иловагӣ 6b) ва аз он шаҳодат медиҳанд, ки 2Rep ба қисми сохтории гидрогели Ҳис-NT2RepCT каме саҳм гузоштааст.Барои гидрогелҳои CT, α-спиралҳо, β-варақҳо ва сохторҳои дуюмдараҷаи тасодуфии спиралӣ мавҷуданд (расми иловагӣ 6d).Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки баъзе қисмҳои КТ α-спиралҳо боқӣ мемонанд, дигарон бошанд, β-варақҳо мешаванд.Ҳамин тариқ, натиҷаҳои спектроскопияи NMR нишон медиҳанд, ки NT барои ташаккули гидрогел муҳим аст ва инчунин ҳангоми омезиш бо 2Rep ва CT ба конформатсияи β-варақ табдил меёбад.Мутобиқи ин, мо ба наздикӣ дарёфтем, ки эҳтимолан дар ҳама панҷ чархи домени NT зипперҳои фазоии амилоид ташаккул меёбанд ва алгоритми Валс минтақаи амилоидогениро дар спирали 1 пешгӯӣ кардааст (расми 4е).
2D спектри 15N-HSQC 10 мг/мл маҳлули His-NT2RepCT пеш (кабуд) ва 19 соат пас аз инкубатсия (сурх) дар 37°C.Қуллаҳои салиб дар спектри сурх ва F24, G136, polyA дар спектри кабуд бо аломатҳои як ҳарфи аминокислотаҳо ва рақамҳои боқимонда ишора карда мешаванд.Вурудҳо вобастагии шиддатнокии сигналро аз вақт барои пасмондаҳои интихобшуда аз доменҳои NT, 2Rep ва CT нишон медиҳанд.б Спектрҳои радиобасомади ҳолати сахти (RFDR) гидрогелҳои His-NT2RepCT.Таносуби пасмондаҳои Cα/Cβ, ки дар спектрҳои RFDR мушоҳида шудаанд, бо муқоиса бо тағиротҳои кимиёвии модели пептидҳо ва арзишҳое, ки аз омор82,83 ва сохторҳои дуюмдараҷаи онҳо гирифта шудаанд, муайян карда шуданд.SSB - банди паҳлӯи даврзананда.в Спектрҳои якченакаи маҳлули 15N-HSQC 10 мг/мл NT ҳангоми инкубатсия дар 37 °C барои 36 соат.Воридот шиддатнокии ҳаҷмро нисбат ба вақт нишон медиҳад.г Спектрҳои ҳолати сахти RFDR аз гидрогелҳои NT.Таносуби боқимондаҳои Cα/Cβ ва сохторҳои дуюмдараҷаи онҳо, ки дар спектрҳои RFDR мушоҳида мешаванд, нишон дода шудаанд.e Дар асоси профили майли фибрилятсияи NT45.79 аз пойгоҳи додаҳои Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Энергияи Розеттаи равзанаи гардиши фазоии гексапептид бо ккал/мол нишон дода шудааст.Сутунҳои сурх гексапептидҳоро бо майли баланди фиброз нишон медиҳанд (энергияи Розетта аз -23 ккал/мол; дар зери хати нуқта).Сутунҳои сабз пораҳои дорои энергияи Rosetta болотар аз ҳадди ақаллро нишон медиҳанд ва аз ин рӯ эҳтимоли камтар сохтани зиперҳои стерикӣ мебошанд.Фрагментҳое, ки пролин доранд, аз таҳлил хориҷ карда шуданд (бе сутунҳо).Майдонҳо минтақаҳои амилоидозро нишон медиҳанд, ки аз ҷониби алгоритми Waltz81 пешбинӣ шудааст (https://waltz.switchlab.org).Дар боло пайдарпайии боқимондаҳои кислотаи аминокислотаҳои NT ҷойгир аст ва намудҳои пасмондаҳое, ки дар сохтори дуюмдараҷаи β пайдо шудаанд (бо спектроскопияи NMR-и сахт муайян карда мешаванд) бо ранги сурх нишон дода шудаанд.Мавқеи панҷ α-спирали NT ҳамчун (H1-H5)28 таъин шудааст.
Дар рН <6,5, HT димеризатсия мешавад, ки ба денатуратсияи гармо ё мочевина тобовар аст18.Барои фаҳмидани он, ки чӣ гуна димеризатсия ва устувории NT ба гелатсия таъсир мерасонад, маҳлулҳои дорои 100 мг/мл NT дар рН 8, 7 ва 6 бо истифода аз санҷиши инверсияи шиша назорат карда шуданд.Намунаҳои NT дар рН 8 ва 7 инкубатсия карда шуда, пас аз 30 дақиқа дар 37 °C гел шуданд, аммо гели рН 8 шаффоф боқӣ монд, дар ҳоле ки gel pH 7 боришоти намоёнро нишон дод (расми 5а).Баръакс, маҳлули дорои HT дар pH 6 гел ба вуҷуд наовард ва пас аз 20 дақиқа дар 37 ° C боришоти калон дидан мумкин аст.Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки худи димерҳо ва/ё устувории баландтари онҳо нисбат ба мономерҳо гелатсияро пешгирӣ мекунанд.Ташаккули боришот барои NT дар pH 7 ва 6 интизор набуд, зеро гузориш дода шудааст, ки NT дар 200 мг/мл27 ҳал мешавад, пас аз денатуратсияи гармӣ ба осонӣ дубора қабат мешавад ва инчунин α-спиралро дар қиматҳои паст нигоҳ медорад. рН 18. Шарҳи эҳтимолии ин ихтилофҳо дар он аст, ки таҷрибаҳои қаблан гузоришшуда дар ҳарорати хонагӣ ё поёнтар ё дар консентратсияи нисбатан пасти сафеда гузаронида шудаанд16,18,19.
Санҷиши инверсияи шишаи NT (100 мг/мл) дар pH 8, 7, 6 ва 154 mM NaCl (pH 8) пас аз инкубатсия дар 37°C.b Спектрҳои CD NT бо ва бе 154 mM NaF ва 154 mM NaCl.Эллиптикии молярӣ дар 222 нм ба таносуби қабатҳои табиӣ табдил меёбад.c Таҳлили инверсионии NT (100 мг/мл) NT* (37 °C ва 60 °C), NTA72R (37 °C) ва His-NT-L6 (37 °C ва 60 °C).г Спектрҳои CD-и мутантҳои NT NT*, NTA72R ва His-NT-L6.Эллиптикии молярӣ дар 222 нм ба таносуби қабатҳои табиӣ табдил меёбад.e Санҷиши инверсияи NTFlSp, NTMiSp ва камшудаи NTMiSp (100 мг/мл).Бари миқёс 5 мм.f CD-спектрҳои NT, NTFlSp, NTMiSp ва камшудаи NTMiSp.Эллиптикии молярӣ дар 222 нм ба таносуби қабатҳои табиӣ табдил меёбад.Спектрҳои пурраи NT дар 25 °C ва 95 °C дар расми иловагии 8 нишон дода шудаанд.
Консентратсияи физиологии намак таъсири мутақобилаи электростатикиро байни зербахшҳои NT ва димеризатсияи интиқоли NT ба pH18 пасттар муайян мекунад.Мо дарёфтем, ки мавҷудияти 154 mM NaCl ва NaF воқеан мутаносибан гелатсияро бозмедорад (расми 5а, б; Расми 2б) ва ин намакҳо устувории гармии мономерҳои NT-ро зиёд мекунанд (расми 5б, Расми 8). .Он инчунин нишон медиҳад, ки баланд бардоштани устуворӣ, на димеризатсия, ташаккули гелро пешгирӣ мекунад.
Барои омӯхтани минбаъдаи нақши димеризатсияи сафеда ва устуворӣ дар gelation, мо ду мутант, NT* ва NTA72R-ро истифода бурдем, ки онҳо низ дар сатҳи пасти pH28.30 мономерӣ боқӣ мемонанд.NT* мутанти баргардонидани заряди дукарата мебошад, ки дар он тақсимоти намоёни заряди диполярии мономер ҳамвор карда мешавад, ки димеризатсияро пешгирӣ мекунад ва устувории мономерро ба таври назаррас афзоиш медиҳад.NTA72R як диполаи заряднок аст, аммо Ала бо Арг ивазшуда дар сарҳади димер ҷойгир аст, аз ин рӯ мутацияҳо ба таъсири мутақобилаи зерқисмҳои барои димеризатсия зарурӣ халал мерасонанд.Ҳангоми инкубатсия дар ҳарорати 37°С, NT* гидрогелро ба вуҷуд наовард, дар ҳоле ки NTA72R барои 15 дақиқа гели ношаффоф ба вуҷуд овард (расми 5c).Азбаски ҳам NT* ва ҳам NTA72R димеризатсия шуда наметавонанд, вале дар устувории мономер фарқ мекунанд (расми 5d), ин натиҷаҳо ба таври қатъӣ шаҳодат медиҳанд, ки устувории баланди термодинамикӣ NT-ро аз гелшавӣ пешгирӣ мекунад.Инро чунин факт низ тасдик мекунад, ки ХТ* хангоми дар харорати баланд ноустувор буданаш (баъди 8 дакика дар 60°С; расми 5в) гел ба вучуд меорад.Қаблан нишон дода шуда буд, ки миқдори зиёди метионин дар NT қабати табиии онро моеъ мекунад ва шаш ивазкунандаи Met ба Leu (дар ин ҷо бо номи His-NT-L6 номида мешавад) мономери NT46-ро сахт устувор мекунанд.Дар асоси тахмине, ки барои ташаккули гели NT чандирии сохторӣ лозим аст, мо дарёфтем, ки мутант устувори His-NT-L6 дар 37 °C гел нашудааст (Расми 5c, d).Аммо Ҳис-NT-L6 инчунин ҳангоми инкубатсия дар 60°С дар 60 дақиқа гел ба вуҷуд овард (расми 5в).
Қобилияти NT барои табдил додани сохторҳои β-варақ ва ташаккули гидрогелҳо ба назар мерасад, ки ба баъзе доменҳои NT-и спидроин дахл дорад, аммо на ҳама.NT аз навъҳои гуногуни абрешим ва навъҳои тортанакҳо, Trichonephila clavipes (NTFlSp), сарфи назар аз миқдори нисбатан ками метионин ва устувории гармии баланди онҳо гелҳо ташкил карданд (расми 5e, f ва Ҷадвали иловагии 2).Баръакси ин, NT аз спидроини хурди сафедаи ампулярӣ аз Araneus ventricosus (NTMiSp) бо устувории пасти гармӣ ва миқдори зиёди метионин гидрогелҳоро ташкил накардааст (Ҷадвали иловагӣ 2 ва Расми 5e, f).Охирин метавонад бо мавҷудияти пайвандҳои дисульфиди дохилимолекулярӣ алоқаманд бошад29,47.Пайваста, вақте ки пайвандҳои дисульфидии NTMiSp коҳиш ёфтанд, пас аз инкубатсия дар 37°С дар тӯли 10 дақиқа гидрогел ба вуҷуд омад (расми 5е).Хулоса, бояд гуфт, ки чандирии сохторӣ меъёри муҳим, вале на ягона, барои ташаккули гел аз НТ мебошад.Омили дигаре, ки метавонад мувофиқ бошад, майл ба ташаккули фибрилҳои амилоид аст ва таҳлил бо пойгоҳи додаҳои зиппер ва алгоритми Waltz таносуби байни қобилияти ташаккули гелҳо ва мавҷудияти минтақаҳои амилоидогенӣ ва инчунин дараҷаи минтақаҳои пешбинишударо нишон дод. барои ташаккул додани зиперҳои стерикӣ.Муносибат вуҷуд дошт (Ҷадвали 2 ва Расми 9).
Қобилияти НТ дар шароити мусоид фибрилҳо ва гелҳо ташкил кардан моро водор сохт, ки фарзия кунем, ки омезиши NT бо дигар порчаҳои сафеда ҳоло ҳам метавонад гелҳоро бо функсияи пурраи шарикони синтез ташкил кунад.Барои санҷидани ин, мо мутаносибан протеини флуоресцентии сабз (GFP) ва фосфорилазаи пурин нуклеозидро (PNP) дар C-терминуси NT ҷорӣ кардем.Протеинҳои синтези ҳосилшуда дар E. coli бо ҳосили ниҳоии хеле баланд (150 мг/л ва 256 мг/л колбаҳои ларзиш барои His-NT-GFP ва His-NT-PNP) ифода карда шуданд, ки бо он чизе ки нишон дода шудааст, мувофиқат мекунад. барои дигар сафедаҳое, ки ба NT реф.30. Протеинҳои синтези His-NT-GFP (300mg/mL) ва His-NT-PNP (100mg/mL) пас аз 2 соат ва 6,5 соат дар 37°C гелҳо ташкил карданд ва муҳимтар аз ҳама, фраксияи GFP бетағйир монд.пас аз гелация мушохида карда мешавад, ки >70 фоизи шиддатнокии ибтидоии флуоресценти баъд аз гелатсия боки мемонад (расми 6а).Барои чен кардани фаъолияти PNP дар маҳлулҳо ва гелҳои ӯ-NT-PNP, мо маҷбур шудем, ки протеини синтезро бо NT ҳал ​​кунем, зеро фаъолияти ферментативии препарати тоза аз доираи муайянкунии таҳлил дар консентратсияи геллинг берун буд.Геле, ки бо омехтаи дорои 0,01 мг/мл His-NT-PNP ва 100 мг/мл NT ташкил шудааст, 65% фаъолияти ферментативии ибтидоии намунаҳои пеш аз инкубатсияшударо нигоҳ дошт (расми 6б).Дар давоми андозагирӣ гел бетағйир монд (расми 10).
Шиддати нисбии флуоресцентсия пеш аз гелизатсияи His-NT-GFP (300 мг/мл) ва шишаи баръакс дорои гидрогели His-NT-GFP (300 мг/мл) дар зери нури намоён ва ултрабунафш.Нуқтаҳо андозагирии инфиродӣ (n = 3) нишон медиҳанд, сатрҳои хато инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.Арзиши миёна дар маркази сатрҳои хато нишон дода шудааст.б Фаъолияти PNP тавассути таҳлили флюорометрӣ бо истифода аз маҳлулҳо ва гелҳои иборат аз NT (100 мг/мл) ва омехтаи дорои 0,01 мг/мл his-NT-PNP ва 100 мг/мл доллари нави Тайван ба даст оварда шуд.Дар дохил шишаи чаппашуда нишон дода шудааст, ки дорои гидрогели дорои His-NT-PNP (барои миқёси 5 мм) мебошад.
Дар ин ҷо, мо дар бораи ташаккули гидрогелҳо аз NT ва дигар сафедаҳои рекомбинатии спидроин тавассути инкубатсияи маҳлули сафеда дар 37 ° C гузориш медиҳем (Расми 1).Мо нишон медиҳем, ки гелатсия бо табдили α-спиралҳо ба қабатҳои β ва ташаккули фибрилҳои амилоидмонанд алоқаманд аст (расмҳои 3 ва 4).Ин бозёфт тааҷҷубовар аст, зеро NTҳо бастаҳои печонидашудаи панҷ-спирали глобулярӣ мебошанд, ки бо ҳалшавандагии бениҳоят баланд ва устувории баланд дар консентратсияи >200 мг/мл дар 4°С дар тӯли чанд рӯз маълуманд27.Илова бар ин, NT-ҳо пас аз денатуратсияи гармӣ дар консентратсияи пасти сафеда дар μM ба осонӣ дубора ҷамъ мешаванд.Мувофиқи натиҷаҳои мо, ташаккули фибрил маҷмӯи консентратсияи сафедаҳои >10 мг/мл ва ҳарорати каме баландро талаб мекунад (расми 1).Ин ба ақидае мувофиқ аст, ки фибрилҳои амилоид метавонанд аз сафедаҳои глобулярӣ печонидашуда, ки аз сабаби тағирёбии гармӣ дар шароити физиологӣ дар ҳолати қисман кушодаанд, ба вуҷуд меоянд 48.Намунаҳои сафедаҳое, ки ин табдилро аз сар мегузаронанд, инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин ва лизозиме51,52,53 мебошанд.Гарчанде ки NT дар ҳолати аслии худ α-спирал аст, тақрибан 65% занҷири полипептид бо ташаккули зиперҳои стерикӣ мувофиқ аст (расми 4е) 45.Азбаски мономер ба таври динамикӣ ҳаракат мекунад46, он метавонад ин минтақаҳои потенсиалии амилоидогениро дар ҳарорати мӯътадил фош кунад ва дар консентратсияи баланди сафедаи умумӣ метавонад ба консентратсияи критикӣ барои ташаккули фибрилҳои амилоид54 бирасанд.Пас аз ин далел, мо таносуби манфии байни консентратсияи спидроин ва вақти гелатсияро дарёфт кардем (расми 1в) ва агар конформатсияи мономерии NT ё бо мутация (NT*, His-NT-L6) ё бо иловаи намак устувор карда шавад, метавонад пешгирии пайдоиши он гидрогелхои ташаккулёбанда (расми 5).
Дар аксари њолатњо фибрилњои амилоидї аз мањлул њамчун боришот нопадид мешаванд, вале дар шароити муайян онњо метавонанд гидрогелњо ташкил диҳанд55,56,57.Фибрилҳои гидрогел ташкилкунанда одатан таносуби баланд доранд ва тавассути пайвастагии молекулавӣ шабакаҳои устувори сеченакаро ташкил медиҳанд,55,58 ба натиҷаҳои мо мувофиқат мекунанд.Барои ташаккули гидрогел дар vitro, сафедаҳо аксар вақт пурра ё қисман кушода мешаванд, масалан, тавассути таъсири ҳалкунандаҳои органикӣ, ҳарорати баланд (70-90 ° C) ва / ё рН паст (1,5-3,0) 59,60,61,62.Гидрогелҳои спидроин, ки дар ин ҷо тавсиф шудаанд, коркарди сахтро талаб намекунанд ва инчунин барои устувор кардани гидрогелҳо агентҳои пайвандкуниро талаб намекунанд.
Қаблан гузориш дода шуда буд, ки такрори спидроин ва QD, ки ба назар мерасанд, ҳангоми ресандагии абрешим ивазшавии β-варақро мегузаронанд, гидрогелҳоро ташкил медиҳанд.Дар муқоиса бо бозёфтҳои мо, вақтҳои инкубатсия ва/ё ҳарорати инкубатсия мутаносибан ба таври назаррас дарозтар ё баландтар буданд ва гидрогелҳои натиҷа аксар вақт ношаффоф буданд (Расми 7 ва Ҷадвали иловагии 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Илова ба вақти тези гел, гидрогелҳои NT >300 мг/мл (30%) аз ҳама дигар гидрогелҳои рекомбинатии сафедаи абрешими тортанак, инчунин гидрогелҳои табиӣ ба монанди желатин, алгинат (2%), агар (0,5%) бартарӣ доштанд. ) ва коллаген.(0,6%) (Расми 7 ва Ҷадвали 1 ва 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Вақти гел ва модули чандирии гидрогелҳо дар ин таҳқиқот бо дигар гидрогелҳои бар спидроин асосёфта ва гидрогелҳои табиии интихобшуда муқоиса карда шуданд.Иқтибосҳо дар баробари тавсифи шароити gelation дода мешаванд.APS персулфат аммоний, ҳарорати хонагӣ.Маълумоти 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Чунин ба назар мерасад, ки тортанакҳо роҳҳои пешгирии гели спидроинро ҳангоми нигоҳдорӣ таҳия кардаанд.Сарфи назар аз консентратсияи баланди сафеда дар ғадуди абрешим, минтақаи калони такрории бо домени терминалӣ алоқаманд маънои онро дорад, ки консентратсияи намоёни NT ва CT дар ғадуд тақрибан ба 10-20 мг / мл дар сарҳади ин таҳқиқот мувофиқат мекунад.барои ташаккули гидрогел дар vitro мушоҳида мешавад.Илова бар ин, консентратсияи шабеҳи намакҳо 16 мӯътадил NT, чунон ки дар ғадудҳои абрешим (расми 5б).Конформатсияи NT дар ситозоли E. coli омӯхта шудааст ва муайян карда шуд, ки нисбат ба вақти санҷиш дар in vitro зичтар печонида шудааст ва минбаъд нишон медиҳад, ки намак ё дигар омилҳо ба ҷамъшавии он дар vivo монеъ мешаванд.Бо вуҷуди ин, қобилияти NTs барои табдил додани фибрилҳои β-варақ метавонад барои ташаккули филамент муҳим бошад ва бояд дар таҳқиқоти оянда тафтиш карда шавад.
Илова ба ҷанбаҳои нави фибрилҳои ба NT-амилоид монанд ва ташаккули гидрогел, ки дар ин таҳқиқот мушоҳида шудааст, мо инчунин нишон медиҳем, ки ин падида метавонад барномаҳои биотехнологӣ ва биотиббӣ дошта бошад (расми 8).Ҳамчун далели консепсия, мо NT-ро бо GFP ё PNP муттаҳид кардем ва нишон додем, ки протеини синтез ҳангоми инкубатсия дар 37 °C инчунин гидрогелҳоро ташкил медиҳад ва фраксияҳои GFP ва PNP пас аз гелатсия фаъолияти худро асосан нигоҳ медоранд (Расми 6).Фосфорилазаҳои нуклеозидҳо катализаторҳои муҳими синтези аналогҳои нуклеозидҳо мебошанд75, ки кашфиёти моро барои саноати биофармацевтика муҳим мегардонад.Консепсияи ифодаи сафедаҳои синтез, ки дар шароити мусоид гидрогелҳои шаффофро ташкил медиҳанд, имкон медиҳад, ки гидрогелҳои функсионалӣ бо хосиятҳои мусоид барои доираи васеи барномаҳо, аз қабили иммобилизатсияи ферментҳо, баровардани доруҳои назоратшаванда ва муҳандисии бофтаҳо.Илова бар ин, NT ва NT* нишондиҳандаҳои самараноки ифода мебошанд30, ки ин маънои онро дорад, ки NT ва вариантҳои он метавонанд барои тавлиди баландсуръати сафедаҳои синтези ҳалшаванда ва эҷоди минбаъдаи сафедаҳои мақсадноки беимбилизатсияшуда дар гидрогелҳои 3D истифода шаванд.
NT дар консентратсияи паст (µM) ва 37°С ҳалшаванда, α-спиралӣ ва устувор аст.Дар ҳамон ҳарорат, вале дар консентратсияи зиёд (>10 мг/мл), НТ гелҳоеро ташкил медиҳад, ки аз фибрилҳои амилоидмонанд иборатанд.Протеинҳои синтези NT инчунин гелҳои фибрилляриро бо порчаҳои синтези комилан функсионалӣ ташкил медиҳанд, ки ба сафедаҳои гуногун имкон медиҳанд, ки дар гидрогелҳои 3D бо истифода аз NT безарар карда шаванд.Поён: NT (PDB: 4FBS) ва тасвирҳои шабакаҳои нахҳо ва сохторҳои сафедаи алоқаманд (фарз ва ба миқёс кашида нашудаанд, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4R).
Конструксияҳо (ниг. ба Ҷадвали иловагии 4 барои рӯйхати пурра, аз ҷумла пайдарпаии кислотаҳои аминокислотаҳо) ба плазми pT7 клон карда шуданд ва ба E. coli BL21 (DE3) табдил дода шуданд.E. coli дорои плазмидҳои муҳандисӣ дар шўрбои Лурия бо канамицин (70 мг/л) васл карда шуда, дар як шабонарӯз дар 30°C ва 250 чархзанӣ парвариш карда шуд.Пас аз он фарҳанг 1/100 ба муҳити LB дорои канамицин эм карда шуд ва дар 30 ° C ва 110 чархзанӣ то ба 0,8 расидани OD600 парвариш карда шуд.Барои таҳқиқоти NMR, бактерияҳо дар муҳити минималии M9 парвариш карда шуданд, ки дорои 2 г D-глюкоза 13C (Aldrich) ва 1 г хлориди аммоний 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) барои тамғагузории сафеда бо изотопҳо.Ҳароратро то 20 дараҷа паст кунед ва бо 0,15 мм изопропилтиогалактопиранозид (консентратсияи ниҳоӣ) ифодаи сафедаро ба вуҷуд оред.Пас аз ифодаи сафедаи шабона, ҳуҷайраҳо дар 7278 × г, 4 ° C барои 20 дақиқа ҷамъоварӣ карда шуданд.Пелетҳои ҳуҷайра дар 20 мм Tris-HCl, рН 8 дубора боздошта шуданд ва то истифодаи минбаъда ях карданд.Ҳуҷайраҳои обшуда бо истифода аз вайронкунандаи ҳуҷайра (машинаҳои силсилаи TS, Constant Systems Limited, Англия) дар 30 кПа лизис карда шуданд.Сипас, лизатҳо дар 25,000 г барои 30 дақиқа дар 4 ° C центрифуга карда шуданд.Барои NTMiSp, пеллет баъдан дар 2 М мочевина, 20 mM Tris-HCl, pH 8 дубора боздошта шуд ва барои 2 дақиқа (2 сония даргир/хомӯш, 65%) соникатсионӣ карда шуд, сипас боз дар 25,000 xg, 4 ° C дар дохили центрифуга карда шуд. 30 дақиқа.Supernatant ба сутуни Ni-NTA бор карда шуд, бо 20 мм Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 шуста шуд ва дар ниҳоят сафеда бо 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8 элюта карда шуд. Барои тавлиди NT2Rep. NTCT, ҳозимаи тромбин макони (ThrCleav) байни Ҳис ва NT -ро муаррифӣ мекунад.Ҷойҳои ҷудошавии тромбин инчунин дар His-NT-ThrCleav-2Rep (истеҳсоли 2Rep), His-thoredoxin-ThrCleav-NT (истеҳсоли NT), His-thoredoxin-ThrCleav-CT (истеҳсоли CT), His-thioredoxin-ThrCleav-NT мавҷуданд. .* (NT* истеҳсол мекунад), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (истеҳсоли NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (истеҳсоли NTF1Sp) ва Гис-Сульфат Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMSp истеҳсол мекунад).Конструксияҳо бо тромбин (1: 1000) ҳазм карда шуданд ва дар як шабонарӯз дар 4 ° C бо 20 mM Tris-HCl, pH 8, бо истифода аз мембранаи диализии Spectra/Por бо ҳадди вазни молекулавии 6-8 кДа диализ карда шуданд.Пас аз диализ, маҳлул ба сутуни Ni-NTA бор карда мешавад ва партови дорои протеини манфиатдор ҷамъ карда мешавад.Консентратсияи сафедаҳо тавассути чен кардани ҷабби ултрабунафш дар 280 нм бо истифода аз коэффисиенти нобудшавии ҳар як сафеда муайян карда шуд, ба истиснои NTF1Sp, ки таҳлили Брэдфордро мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда истифода кардааст.Покӣ бо роҳи электрофорези гелии SDS полиакриламиди (4-20%) ва ранг кардани кабуди олиҷаноби Coomassie муайян карда шуд.Протеинҳо бо истифода аз филтрҳои центрифуга (VivaSpin 20, GE Healthcare) дар 4000 xg бо қатъи вазни молекулавии 10 кДа дар давраҳои 20 дақиқа мутамарказ карда шуданд.
Маҳлули протеинро об кунед ва бодиққат 150 мклро ба шишаи шаффофи септуми 1 мл (8 x 40 мм Thermo Scientific) пипет кунед.Барои пешгирии бухоршавӣ қубурҳоро бо парафилм пӯшониданд.Намунаҳо (n = 3) дар 37 ° C ё 60 ° C инкубатсия карда шуданд ва давра ба давра барои мушоҳида кардани гелатсия табдил дода шуданд.Намунаҳое, ки гел набуданд, ҳадди аққал як ҳафта инкубатсия карда шуданд.Пайвастҳои дисульфиди NTMiSp бо 10 mM DTT барои 10 μM протеин кам кунед.Барои таҳлили гелатсияи рӯйпӯшҳои абрешими табиии тортанак тортанакҳои пулии Шветсия бурида шуд, ду ғадудҳои асосии ампулятсия дар 200 мкл буфери Tris-HCl рН 8 ҷойгир карда шуданд ва буриданд, то пӯшиш аз ғадудҳо ҷудо шавад..Мазмуни ғадудҳо дар буфер, 50 мкл барои муайян кардани вазни хушк (бо инкубатсия кардани шишаҳои кушода дар ҳарорати 60 ° C то вазни доимӣ) ва 150 мкл барои гелизатсия дар 37 ° C гудохта мешавад.
Геометрия / асбоби ченкунӣ аз пӯлоди зангногир бо истифода аз лавҳаи параллелӣ бо диаметри боло 20 мм ва холигии 0,5 мм сохта шудааст.Намунаро аз 25 °C то 45 °C ва боз то 25 °C бо суръати 1 °C дар як дақиқа бо истифода аз пӯлоди зангногир аз пӯлоди Пелтиер гарм кунед.Андозагирии ларзиш дар басомади 0,1 Гц ва дар минтақаи часпакии хаттии мавод дар шиддати 5% ва 0,5% барои намунаҳои 100 мг/мл ва 300-500 мг/мл гузаронида шуданд.Барои пешгирии бухоршавӣ камераи намии фармоиширо истифода баред.Маълумот бо истифода аз Prism 9 таҳлил карда шуд.
Барои ҷамъоварии спектрҳои инфрасурх (IR) дар ҳарорати хонагӣ аз 800 то 3900 см-1.Дастгоҳи ATR, инчунин роҳи рӯшноӣ тавассути спектрометр, пеш аз ва дар давоми таҷриба бо ҳавои хушки филтршуда тоза карда мешавад.Маҳлулҳо (500 мг/мл барои кам кардани қуллаҳои азхудкунии об дар спектрҳо) ба кристалҳо пипета карда шуданд ва гелҳо (500 мг/мл) пеш аз андозагирӣ ташкил карда шуданд ва сипас ба кристалҳо интиқол дода шуданд (n = 3).1000 скан бо қарори 2 см-1 ва сифр сифр сифри вазифаи 2 сабт карда шуданд. Ҳосилаи дуюм бо истифода аз OPUS (Bruker) бо истифода аз диапазони ҳамворкунии нӯҳ нуқта ҳисоб карда шуд.Спектрҳо ба ҳамон минтақаи интегратсия байни 1720 ва 1580 см-1 бо истифода аз Ф. Менгес «Spectragryph - нармафзори спектроскопии оптикӣ» нормал карда шуданд.Дар спектроскопияи ATR-IR, умқи вуруди шуои инфрасурх ба намуна аз рақами мавҷ вобаста аст, ки дар натиҷа дар рақамҳои мавҷҳо нисбат ба рақамҳои баландтар азхудкунии сахттар мешавад.Ин эффектҳо барои спектрҳои дар расм нишон додашуда ислоҳ карда нашудаанд.3 зеро онҳо хеле хурд мебошанд (расми 4).Спектрҳои ислоҳшудаи ин рақам бо истифода аз нармафзори Bruker OPUS ҳисоб карда шуданд.
Аслан, миқдори ҳамаҷонибаи конформатсияҳои сафедаҳо пас аз деконволютсияи боэътимоди ҷузъҳо дар қуллаи амид I имконпазир аст.Аммо дар амал баъзе монеахо ба миён меоянд.Садо дар спектр метавонад ҳамчун қуллаҳои (дурӯғ) ҳангоми деконволюсия пайдо шавад.Илова бар ин, қуллаи аз хамшавии об ба мавқеи қуллаи амид I мувофиқат мекунад ва метавонад барои намунаҳое, ки миқдори зиёди об доранд, ба монанди гели обии дар ин ҷо омӯхташуда, андозаи шабеҳ дошта бошад.Аз ин рӯ, мо кӯшиш накардем, ки қуллаи амид I-ро пурра таҷзия кунем ва мушоҳидаҳои мо бояд танҳо дар дастгирии усулҳои дигар, ба монанди спектроскопияи NMR баррасӣ карда шаванд.
Маҳлулҳои 50 мг / мл NT ва His-NT2RepCT дар як шабонарӯз дар 37 ° C гел карда шуданд.Сипас гидрогел бо 20 мм Tris-HCl (pH 8) то консентратсияи 12,5 мг/мл омехта карда шуд, хуб ларзонда шуд ва барои шикастани гел пипета карда шуд.Сипас, гидрогел 10 маротиба бо 20 mM Tris-HCl (pH 8) омехта карда шуд, 5 мкл намуна ба шабакаи миси бо формвар пӯшонидашуда татбиқ карда шуд ва намунаи зиёдатӣ бо коғази блотинг хориҷ карда шуд.Намунаҳо ду маротиба бо 5 мкл оби MilliQ шуста шуданд ва бо формати 1% уранил барои 5 дақиқа ранг карда шуданд.Доғи зиёдатиро бо коғази абсорбент тоза кунед, пас торро бо ҳаво хушк кунед.Тасвир дар ин шабакаҳо бо истифода аз FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, ки дар 100 кВ кор мекунад, сурат гирифт.Тасвирҳо дар андозаи x 26,500 ва x 43,000 бо истифода аз камераи Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстер, Олмон) сабт карда шуданд.Барои ҳар як намуна (n = 1), 10-15 тасвир сабт карда шуд.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) барои таҳлили тасвир ва андозагирии диаметри нах (n = 100, нахҳои гуногун) истифода шудааст.Призми 9 барои иҷрои озмоишҳои ҷудонашуда (ду думдор) истифода мешуд.Миёнаи фибрилҳои His-NT2RepCT ва NT мутаносибан 11,43 (SD 2,035) ва 7,67 (SD 1,389) нм буд.Фосилаи эътимод (95%) -4,246 то -3,275 аст.дараҷаҳои озодӣ = 198, p <0,0001.
80 мкл намунаҳои моеъи дорои 10 мкМ тиофлавин T (ThT) дар се нусха (n = 3) дар шароити статикӣ бо истифода аз лавҳаҳои поёни сиёҳи 96-чоҳи сиёҳ (Corning Glass 3881, ИМА) чен карда шуданд.Тафовутҳои флуоресцентҳо бо истифода аз филтри ҳаяҷонбахши 440 нм ва филтри эмиссияи 480 нм (FLUOStar Galaxy аз BMG Labtech, Оффенбург, Олмон) сабт карда шуданд.Сигнали ThT на сершуда ва на хомӯш карда шуд, зеро таҷрибаҳо бо консентратсияи гуногуни ThT бидуни тағир додани шиддати сигнал гузаронида шуданд.Барои андозагирии туман абсорбенсро дар 360 нм сабт кунед.Барои таҷрибаҳои тухмӣ, гелҳои 100 мг / мл дар 37 ° C ташкил карда шуданд, дубора суспензия карда шуданд ва барои кишти тухмӣ дар таносуби молярии 5%, 10% ва 20% истифода шуданд.Маълумот бо истифода аз Prism 9 таҳлил карда шуд.
Захираҳои His-NT2RepCT ва NT >100 мг/мл-ро дар ях об кунед ва тавассути филтри 0,22 мкм филтр кунед.Консентратсияҳо тавассути чен кардани абсорбент дар 280 нм бо истифода аз Nanodrop ҳисоб карда шуданд.Дар чоҳҳои лавҳаи сиёҳи 96-чоҳаи ҳатмӣ (Корнинг) бо қаъри равшан, намунаҳо то 20 мг/мл дар 20 mM Tris-HCl pH 8 омехта карда шуданд ва бо 5 мкМ ThT (консентратсияи ниҳоӣ), консентратсияи умумии намуна омехта карда шуданд. Ҳаҷми 50 мкл.Намунаҳо ҳар 10 дақиқа дар 37 °C дар микроскопи CellObserver (Zeiss) бо канали интиқоли нур ва маҷмӯи филтрҳои барангезиш ва эмиссияи FITC барои тасвири ThT тасвир карда шуданд.Барои тасвир линзаи 20x/0,4 истифода мешавад.Zen Blue (Zeiss) ва ImageJ (https://imagej.nih.gov/) барои таҳлили тасвир истифода шуданд.Гельҳо инчунин аз маҳлулҳои NT ва His-NT2RepCT дар консентратсияи 50 мг/мл, ки дорои 20 mM Tris pH 8 ва 5 μM ThT мебошанд ва дар 37 ° C барои 90 дақиқа инкубатсия карда шуданд.Қисмҳои гел ба чоҳи нав, ки дорои 20 mM Tris, pH 8 ва 5 μM ThT дар лавҳаи поёни сиёҳи 96 чоҳи тозаи ҳатмӣ нестанд, интиқол дода шуданд.Флуорессенсияи сабз ва тасвирҳои саҳроии равшанро дар андозаи 20x/0,4 калон кунед.ImageJ барои таҳлили тасвир истифода шуд.
Спектрҳои ҳалли NMR дар 310 К дар спектрометри 600 МГц Bruker Avance Neo, ки бо QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) муҷаҳҳаз шудааст, ба даст оварда шуданд.Намунаҳои NMR дорои 10 мг/мл протеини якхела, ки бо 13C, 15N нишонгузорӣ шудаанд, дар 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (в/в) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) гудохта шудаанд. .Гузаришҳои кимиёвии NT2RepCT дар pH 6.7 барои таъин кардани қуллаи 23 дар спектри 2D 15N-HSQC истифода шуданд.
Дар спектрометри Bruker Avance III HD дар 800 МГс, ки бо зонди бе электронии 3,2 мм 13C/15N{1H} муҷаҳҳаз шудааст, спектрҳои кунҷи ҷодугарии чархзании сахти NMR (MAS) 13C, 15N-и гидрогелҳо сабт карда шуданд.Ҳарорати намуна бо истифода аз ҷараёни гази ҳарорати тағйирёбанда дар 277 К назорат карда шуд. Резонанси дученакаи гардиши диполӣ (DARR)76 ва спектрҳои дубора пайвасти басомади радио (RFDR)77 дар басомадҳои MAS 12,5 kHz ва 20 kHz ба даст оварда шуданд.Поляризатсияи салиб (CP) аз 1Н то 13С бо истифода аз рампаи хатӣ аз 60,0 то 48,0 кГц дар 1Н, 61,3/71,6 кГц дар 13С (дар 12,5/20 кГц СМА) ва вақти тамос 0,5-1 мс анҷом дода шуд.Ҳангоми ҷамъоварии маълумот Spinal6478 ҷудокунӣ дар 73,5 kHz истифода шудааст.Вақти ба даст овардани 10 миллисония ва таъхири давр 2,5 сония буд.Муносибатҳои ягонаи Cα/Cβ, ки дар спектрҳои RFDR мушоҳида шудаанд, дар асоси тағиротҳои хоси кимиёвии боқимонда ва коррелятсияҳои чандкарата дар спектрҳои DARR таъин карда шуданд.
Пойгоҳи додаҳои Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) барои арзёбии тамоюлҳои флютер ва энергияи Rosetta барои NT, NTFlSp ва NTMiSp истифода мешуд.Пойгоҳи додаҳои Zipper Rosetta Energy80-ро ҳисоб мекунад, ки якчанд функсияҳои энергетикии ройгонро барои моделсозӣ ва таҳлили сохтори сафедаҳо муттаҳид мекунад.Сатҳи энергетикии -23 ккал/мол ё камтар аз майли баланди фибрилятсия шаҳодат медиҳад.Энергияи камтар маънои устувории ду риштаи β-ро дар конформатсияи зиппер дорад.Илова бар ин, алгоритми Waltz барои пешгӯии минтақаҳои амилоидогенӣ дар NT, NTFlSp ва NTMiSp Ref истифода мешуд.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Маҳлули протеини NT бо буфери 2-(N-морфолино) кислотаи этансульфонӣ (MES) дар pH 5,5 ва 6,0 омехта карда шуд, то рН мутаносибан то рН 6 ва 7 паст шавад.Консентратсияи ниҳоии сафеда 100 мг/мл буд.
Андозаҳо дар спектрометри CD J-1500 (JASCO, ИМА) бо истифода аз кюветаи 300 мкл бо роҳи оптикии 0,1 см гузаронида шуданд.Протеинҳо то 10 мкМ (n = 1) дар буфери фосфати 20 мм (pH 8) ҳал карда шуданд.Барои таҳлили устувории сафедаҳо дар ҳузури намак, сафедаҳо дар ҳамон консентратсияи (n = 1) дар буфери фосфати 20 mM (pH 8), ки мутаносибан 154 mM NaF ё NaCl доранд, таҳлил карда шуданд.Сканҳои ҳарорат дар 222 нм аз 25 ° C то 95 ° C бо суръати гармкунӣ 1 ° C / дақиқа сабт карда шуданд.Таносуби сафедаҳои ба таври аслӣ печонидашуда бо формулаи (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) ҳисоб карда шуд.Илова бар ин, панҷ спектр барои ҳар як намуна аз 260 нм то 190 нм дар 25 ° C ва пас аз гармкунӣ то 95 ° C сабт карда шуданд.Панҷ спектр ба ҳисоби миёна гирифта, ҳамвор карда шуданд ва ба эллиптикаи молярӣ табдил дода шуданд.Маълумот бо истифода аз Prism 9 таҳлил карда шуд.
Шиддати флуорессенсияи His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкЛ) дар се нусха (n = 3) дар плитаҳои 96-чоҳи Corning бо поёни шаффофи сиёҳ (Corning Glass 3881, ИМА) дар шароити статикӣ чен карда шуд.Намунаҳоро бо хонандаи лавҳаи флуоресцентӣ бо дарозии мавҷи ҳаяҷонбахши 395 нм чен кунед ва партовро дар 509 нм пеш аз гелатсия ва 2 соат баъд дар 37°C сабт кунед.Маълумот бо Prism 9 таҳлил карда шуд.
Маҷмӯи санҷиши фаъолияти пурин нуклеозид фосфорилаза (усули флюорометрӣ, Sigma Aldrich) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда истифода шуд.Барои чен кардани фаъолият дар гелҳо ва маҳлулҳои дорои His-NT-PNP, 10 нг His-NT-PNP бо 100 мг/мл NT ба ҳаҷми умумии 2 мкл омехта кунед, зеро гел аз фосилаи муайянкунии маҷмӯа сигнал зиёдтар дод.Назорати гелҳо ва маҳлулҳо бе His-NT-PNP дохил карда шуданд.Андозаҳо ду маротиба гузаронида шуданд (n = 2).Пас аз чен кардани фаъолият, омехтаи реаксия хориҷ карда шуд ва гел аксбардорӣ карда шуд, то боварӣ ҳосил кунед, ки гел ҳангоми ченкунӣ солим боқӣ мемонад.Маълумот бо истифода аз Prism 9 таҳлил карда шуд.
Барои маълумоти бештар дар бораи тарҳрезии омӯзиш, ба реферат омӯзиши табиат нигаред, ки ба ин мақола алоқаманд аст.
Дар расмҳои 1 ва 2 маълумоти ибтидоӣ оварда шудаанд.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, ва 6, Расмҳои иловагӣ.3, расми иловагӣ.5а, г, расми иловагӣ.6 ва расми иловагӣ.8. Маълумот аз ин тадқиқот дар базаи Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 ҷойгир карда шудааст.Маълумоти NMR, ки дар ин таҳқиқот ба даст оварда шудааст, дар анбори BMRBig зери ID вуруд bmrbig36 ҷойгир карда шуданд.Сохторҳои GFP ва PNP аз PDB гирифта шудаанд (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Бархостан, А. ва Йоханссон, Ҷ. ресандагӣ абрешими тортанак сунъӣ.Миллии химия.биология.11, 309–315 (2015).
Бабб, ПЛ ва дигарон.Геноми Nephila clavipes гуногунрангии генҳои абрешими тортанак ва ифодаи мураккаби онҳоро таъкид мекунад.Миллии Генет.49, 895–903 (2017).